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鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我国高发恶性肿瘤之一,其发病机制尚不明确,治疗效果与预后较差。寻找新的治疗方法和靶点具有一定的理论意义和应用价值。研究发现细胞膜内外离子通道的调控与细胞凋亡密切相关。前期的研究表明藤黄酸处理人鼻咽癌CNE-2Z细胞,膜片钳技术记录CNE-2Z细胞的容积敏感性外向整流性氯离子(volume-sensitive outwardly rectifying Cl~-,VSOR Cl~-)电流发生了变化,但这种变化与藤黄酸抗肿瘤作用机制的关联性未见报道。本实验室前期研究证明了新藤黄酸(Gambogenic Acid,GNA)可以抑制多种肿瘤细胞的增殖,与其诱导肿瘤细胞凋亡相关,而是否与内质网途径激活有关值得研究;内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)介导的细胞凋亡是区别于死亡受体和线粒体途径介导的凋亡途径,因此本课题采用GNA干预人鼻咽癌CNE-2Z细胞,探讨VSOR Cl~-通道对内质网途径的激活与诱导CNE-2Z细胞凋亡是否相关,期望通过本研究为GNA的进一步开发利用提供一些理论依据。目的:研究VSOR Cl~-通道在GNA诱导人鼻咽癌CNE-2Z细胞凋亡中的作用,并探讨ERS参与其中的作用与可能机制。方法:1、MTT法检测GNA对CNE-2Z细胞增殖的影响,倒置显微镜观察CNE-2Z细胞形态;DAPI荧光染色和Annexin V-FITC/PI荧光染色观察GNA诱导CNE-2Z细胞凋亡;流式细胞仪检测GNA诱导CNE-2Z细胞的凋亡率。2、采用氯离子荧光探针(MQAE)和膜片钳手段检测GNA对CNE-2Z细胞膜表面的VSOR Cl~-电流的影响。3、MTT法检测非特异性氯离子通道阻断剂(DIDS)和特异性容积敏感性外向整流性氯离子通道阻断剂(DCPIB)预作用后GNA对CNE-2Z细胞增殖的影响;DAPI染色和Annexin V-FITC/PI染色观察DIDS、DCPIB对GNA诱导的CNE-2Z细胞凋亡的影响;流式细胞仪检测DIDS、DCPIB预作用后GNA诱导CNE-2Z细胞凋亡率的变化;DAPI染色观察沉默Cl C-3对GNA诱导CNE-2Z细胞凋亡的影响;Western Blotting法检测沉默Cl C-3后Cl C-3氯通道蛋白的表达;Western Blotting法检测GNA以及DIDS、DCPIB预作用后GNA对CNE-2Z细胞内质网相关蛋白(GRP78、ATF4、CHOP)的表达水平的影响。结果:1、MTT法检测结果表明,与正常对照组相比,不同浓度的GNA处理人鼻咽癌CNE-2Z细胞24 h、48 h后,各给药组细胞存活率降低;DIDS组和DCPIB组对细胞存活率影响较小;与GNA组相比,DIDS(400μmol/L)+GNA(2μmol/L)组、DCPIB(20μmol/L)+GNA(2μmol/L)组的细胞存活率上升,具有显著性差异(P<0.01)。2、倒置显微镜下观察可见,正常对照组细胞贴壁牢固,边缘清晰,几乎无漂浮细胞。低、中浓度GNA给药组部分细胞固缩变圆,体积变小,少量细胞呈半贴壁状态;高浓度GNA给药组,细胞较多脱落,漂浮于培养液中。3、DAPI细胞核染色,荧光显微镜观察发现,正常对照组的细胞核呈现均一暗淡的蓝色,而低、中浓度GNA给药组部分细胞核呈亮蓝色,碎块状致密浓染,少数细胞核可见细胞核内碎裂,具有明显凋亡特征;高浓度GNA给药组凋亡细胞数量明显增加,亮度趋向亮蓝色;DIDS组、DCPIB组出现少量细胞被染成亮蓝色,与GNA组相比,DIDS(400μmol/L)+GNA(2μmol/L)组、DCPIB(20μmol/L)+GNA(2μmol/L)组的细胞被染成亮蓝色的数量减少,表明细胞凋亡降低。4、AV/PI染色,荧光显微镜观察可见,正常对照组、DIDS组和DCPIB组的细胞少量被染成淡绿色,低浓度GNA给药组细胞表面呈明亮的绿色,表明细胞出现了早期凋亡;中、高浓度GNA给药组细胞质显示出不同强度的红色,表明细胞出现了晚期凋亡或发生坏死;与GNA组相比,DIDS(400μmol/L)+GNA(2μmol/L)组、DCPIB(20μmol/L)+GNA(2μmol/L)组的细胞被染成红色的数量下降,表明细胞凋亡降低。5、AV/PI双染经流式细胞仪检测发现,与正常对照组相比,不同浓度GNA处理CNE-2Z细胞24 h后,细胞凋亡率会随着GNA浓度的增加而上升,DIDS组、DCPIB组细胞凋亡率变化不明显;与GNA组相比,DIDS(400μmol/L)+GNA(2μmol/L)组、DCPIB(20μmol/L)+GNA(2μmol/L)组的细胞凋亡率明显下降。6、膜片钳检测结果表明,正常对照组的细胞产生了小而稳定的背景电流;而GNA组细胞,产生了具有明显外向优势的电流,该电流密度随着GNA作用时间延长,逐渐增大,最终达到峰值进入平稳期;该电流没有明显电压依从性失活和时间依从性失活;与GNA组相比,DIDS(400μmol/L)+GNA(2μmol/L)组、DCPIB(20μmol/L)+GNA(2μmol/L)组的电流被明显抑制,差异具有统计学意义(P<0.05)。结果提示GNA激活的是VSOR Cl~-电流,并能被非特异性氯离子通道阻滞剂和特异性容积敏感性外向整流性氯离子通道阻滞剂阻断。7、氯离子荧光探针检测结果发现,与正常对照组相比,GNA组MQAE荧光强度显著增加,具有显著性差异(P<0.01);与GNA组相比,DIDS(400μmol/L)+GNA(2μmol/L)组、DCPIB(20μmol/L)+GNA(2μmol/L)组的MQAE荧光强度都显著减少,差异具有统计学意义(P<0.01)。结果进一步提示GNA可能激活VSOR Cl~-电流,引起氯离子外流。8、荧光显微镜观察和流式细胞仪检测转染率,结果提示Cl C-3 si RNA成功转进CNE-2Z细胞;Western Blotting法检测Cl C-3的沉默情况,与正常对照组相比,Cl C-3 si RNA组的Cl C-3氯通道蛋白表达明显被抑制,具有显著性差异(P<0.01)。结果提示了Cl C-3氯通道蛋白被成功敲除,这为下一步实验提供了基础。9、DAPI细胞核染色,荧光显微镜下观察可见,正常对照组和Cl C-3 si RNA组细胞的细胞核呈现均一暗淡的蓝色,而GNA组细胞核呈亮蓝色,碎块状致密浓染,可见细胞核内碎裂,呈现明显凋亡特征;与GNA组相比,Cl C-3 si RNA+GNA(2μmol/L)组的细胞呈亮蓝色的数量减少。结果提示Cl C-3 si RNA可以减少GNA对CNE-2Z细胞的损害,进一步说明了GNA诱导CNE-2Z细胞凋亡可能与VSOR Cl~-通道有关。10、Western Blotting法检测结果显示,与正常对照组相比,GNA组GRP78蛋白表达下调,ATF4、CHOP蛋白表达上调,结果提示GNA诱导CNE-2Z细胞凋亡,可能与ERS信号通路相关;与正常对照组相比,DIDS组和DCPIB组GRP78、CHOP、ATF4蛋白表达量基本无差异;与GNA组相比,DIDS(400μmol/L)+GNA(2μmol/L)组、DCPIB(20μmol/L)+GNA(2μmol/L)组GRP78蛋白表达量明显上调,CHOP、ATF4蛋白表达量明显下调,具有显著性差异(P<0.01)。结果提示氯通道阻断剂DIDS、DCPIB可以下调GNA诱导的ERS相关蛋白ATF4、CHOP的表达水平,上调蛋白GRP78表达水平,表明ERS发生可能与VSOR Cl~-通道激活有关。结论:GNA可以激活VSOR Cl~-通道,导致ERS发生,从而促使了CNE-2Z细胞的凋亡,进而抑制了CNE-2Z细胞的增殖。