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猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的急性"接触性"高度传染性消化道疾病，主要症状为呕吐、水样腹泻和脱水。PED的波及范围广，在全球均有病例报道。近几年，该病在中国广泛蔓延，造成了严重的经济损失，引起了中国各研究单位对其病原PEDV的关注。目前，PEDV商品化疫苗保护效力在逐年降低，主要有两个原因，一是目前商品化疫苗与流行毒株的抗原性不匹配，二是减活疫苗毒株由于体外适应传代培养而被过度弱化。因此，新型疫苗的开发具有重要意义。本研究旨在通过靶向RNA重组反向操作平台，将2013年流行的3株细胞适应毒株的S基因分别替换掉原疫苗株（DR13）S基因，最终装配出3株重组疫苗毒株作为疫苗候选毒株，为后期研发的新一代减毒活疫苗奠定基础。本研究分为两个部分。第一部分：构建猪流行性腹泻病毒基因工程疫苗载体。选择三株2013年流行的细胞适应毒株KF804028, KF650372, KF650375的S基因作为免疫原性基因。根据Genbank中KF804028，KF650372,KF650375的S基因的序列，通过引物小片段(三条基因共94段)进行overlap PCR，形成一级片段，将融合得到的一级片段连接pJET-Blunt载体进行克隆并且测序。选择测序正确的Blunt载体，用引物进行PCR扩增，形成13段正确的一级片段。将相邻有21bp碱基重合区域的一级片段再次进行PCR片段融合，形成二级片段，同样的方法，逐级放大至四级片段，合成出3段PED流行毒株S (4161bp)基因。PED流行毒株S (4161bp)基因通过同源重组的方法与p-PEDV-ΔS DR13连接，并且克隆测序，从而获得正确的重组质粒，即猪流行性腹泻病毒（PEDV）基因工程疫苗载体。三个重组质粒分别命名为pPEDV-DR13ΔS/KF804028S、pPEDV-DR13ΔS/KF650372S、pPEDV-DR13ΔS/KF650375S。第二部分：重组病毒的拯救。将已经构建好的三个携带流行的细胞适应毒株S基因的重组质粒体外转录成RNA，通过电转，使流行毒株的S基因整合进入PEDV病毒基因组，再将重组的PEDV（rPEDV）感染VERO细胞，从而获得能够在VERO细胞上产生CPE并且连续传代的重组PEDV。三个重组病毒分别命名为PEDV-DR13ΔS/KF804028S、PEDV-DR13ΔS/KF650372S、PEDV-DR13ΔS/KF650375S。