引言卵巢癌是女性生殖系统中恶性程度最高的肿瘤之一。根据中国癌症统计资料显示,过去几年卵巢癌的死亡率一直在上升。目前卵巢癌的临床治疗非常有限,手术、化疗或用新药治疗是主要的治疗手段。在诊断时,超过75%的女性患有晚期卵巢癌(III期或IV期),这些患者的5年生存率低于25%,预期预后较差。由于该肿瘤在早期阶段没有明显的症状以及对化疗药物产生耐药性,使得卵巢癌的治愈率和生存率较低。特别是耐药性的产生涉及复杂的通路机制,是需要克服的一大难题。外泌体是大多数细胞分泌的纳米级(30-100 nm)膜囊泡。它们富含RNA,包括编码RNA和非编码RNA类型,例如miRNA、小核RNA、转运RNA、核糖体RNA等。虽然之前被认为是细胞废物,但新的证据表明,外泌体可通过蛋白质转移、mRNA、miRNA和非编码RNA介导多种生物学功能,包括血管生成、细胞增殖、肿瘤细胞侵袭和转移、免疫应答、相邻或远处细胞的抗原呈递。值得注意的是,肿瘤细胞来源的外泌体可以为肿瘤发展提供合适的微环境,例如细胞增殖、耐药性、血管生成及转移、免疫调控、转移前生态位形成等,而这些特征都在卵巢癌中有所体现。因此,外泌体有望成为卵巢癌潜在的诊断、预后、甚至治疗的手段。已有研究表明腹水中外泌体水平的增加与肿瘤进展相关,表明血液中的外泌体水平与卵巢癌的分期相关。外泌体中大量miRNAs的传递具有影响基因多样性和调控生物途径的能力。本研究从卵巢癌未化疗患者、卵巢癌化疗耐药患者、非癌个体(盆腔炎患者)入手,对卵巢癌未化疗患者腹水、非癌个体腹水、卵巢癌化疗耐药患者腹水中的外泌体miRNAs和mRNAs进行二代测序分析,统计差异表达的外泌体miRNAs和mRNAs并对其进行GO聚类和KEGG通路富集分析,寻找可能与卵巢癌化疗耐药相关的miRNAs和mRNAs,利用TCGA数据库分析miRNAs与卵巢癌患者预后之间的相关性;检测与卵巢癌化疗耐药相关的miRNA在不同卵巢癌细胞株(SKOV3、OVCAR3、OV-90、TOV-112D、ES-2)中的表达情况,然后利用慢病毒载体构建miRNA过表达和沉默卵巢癌细胞株,利用CCK-8试剂盒、流式细胞术、克隆形成实验、Transwell实验,研究miRNA表达量的变化对卵巢癌细胞活力、增殖、凋亡、克隆形成能力、侵袭能力等生物学活动的影响;在此基础上,利用生物信息学软件预测miRNA的可能靶基因,并利用双萤光素酶报告基因检测验证靶基因的正确性,利用慢病毒载体构建靶基因过表达和沉默的卵巢癌细胞株,利用CCK-8试剂盒、流式细胞术、克隆形成实验、Transwell实验,研究该靶基因表达量的变化对顺铂压力下卵巢癌细胞活力、增殖、凋亡、克隆形成能力、侵袭能力等的影响,通过裸鼠荷瘤实验,在动物体内验证该靶基因对卵巢癌细胞生物学指征和化疗耐药的影响。第一部分卵巢癌腹腔外泌体miRNA测序分析目的对卵巢癌未化疗患者腹水、非癌个体腹水、卵巢癌化疗耐药患者腹水中的外泌体miRNAs和mRNAs进行二代测序,寻找样本间差异表达的转录本和卵巢癌化疗耐药相关的外泌体miRNA,及其与卵巢癌患者预后之间的相关性。方法利用RNA提取试剂盒提取卵巢癌未化疗患者腹水、非癌个体腹水、卵巢癌化疗耐药患者腹水中的外泌体总RNA,构建小RNA测序文库,利用二代测序方法进行外泌体miRNAs和mRNAs测序,统计样本间差异表达的转录本,并进行GO聚类、KEGG通路富集分析和韦恩图分析,利用TCGA数据库分析差异表达miRNAs与卵巢癌患者预后之间的关系,利用miRNAs荧光定量PCR检测miRNAs在卵巢癌细胞中的表达情况。结果二代测序结果显示,在过滤掉噪音数据的基础上,所有测序样本的高质量数据均达到了97%以上,说明测序原始数据质量评估较好,小RNA测序得到的tag序列的长度分布集中在20-22 bp之间,各样本间存在较多的miRNA差异表达。与NC(非癌个体)组数据相比,OC-NT(卵巢癌未化疗个体)组中有243个miRNAs上调,215个miRNAs下调;OC-CR(卵巢癌化疗耐药个体)组中有261个miRNAs上调,276个miRNAs下调。与OC-NT组相比,OC-CR组中有197个miRNAs上调,172个miRNAs下调。维恩图分析结果显示,在3个样本间都差异表达的miRNA共有8个,分别为miR-483-5p、miR-320b、miR-320c、miR-320d、miR-193a-5p、miR-323a-3p、miR-1228-5p、miR-222-5p;其中,miR-483-5p和miR-320b在OC-CR样本中的表达差异最显著。卵巢癌患者生存曲线分析表明,miR-483-5p高表达的患者生存率整体低于miR-483-5p低表达患者的生存率(P<0.05),说明miR-483-5p的表达与卵巢癌患者的预后相关。小结二代测序数据质量评估较好,各样本间存在较多的miRNA差异表达,在3个样本间都差异表达的miRNA共有8个,其中miR-483-5p在OC-CR样本中的表达差异最显著。miR-483-5p的高表达与卵巢癌患者的不良预后显著相关。第二部分miR-483-5p对卵巢癌细胞生物学功能的影响目的检测miR-483-5p在不同卵巢癌细胞株中的表达情况,构建miR-483-5p过表达和沉默卵巢癌细胞株,研究miR-483-5p表达量变化对卵巢癌细胞在体外生物学行为(细胞活力、增殖、凋亡、克隆形成能力、侵袭能力)的影响。方法利用miRNA荧光定量PCR技术检测miR-483-5p在卵巢癌细胞株SKOV3、OVCAR3、OV-90、TOV-112D、ES-2中的表达情况。利用慢病毒载体构建miR-483-5p过表达和沉默卵巢癌细胞株,利用CCK-8试剂盒、流式细胞术、克隆形成实验、Transwell实验,研究miR-483-5p表达量的变化对卵巢癌细胞活力、增殖、凋亡、克隆形成能力、侵袭能力等生物学活动的影响。结果miRNA荧光定量PCR结果显示,miRNA-483-5p在不同的卵巢癌细胞株中的表达各不相同,其中OVCAR3细胞株中miRNA-483-5p的表达水平最高,SKOV3细胞株中miRNA-483-5p的表达水平较低。通过荧光定量PCR技术,检测构建的miRNA-483-5p过表达和沉默卵巢癌细胞株中miRNA-483-5p的表达量,结果显示,miRNA-483-5p过表达卵巢癌细胞株中miRNA-483-5p的表达量显著高于过表达对照组(P<0.001),而miRNA-483-5p沉默细胞株中miRNA-483-5p的表达量变化与沉默对照组相比没有显著性差异。CCK-8实验结果显示,miRNA-483-5p过表达可以显著增强卵巢癌细胞的活力,miRNA-483-5p沉默能够显著降低卵巢癌细胞的活力(P<0.05)。细胞凋亡检测结果显示,miRNA-483-5p过表达可以显著抑制卵巢癌细胞凋亡(P<0.01),miRNA-483-5p沉默可以显著促进卵巢癌细胞凋亡(P<0.05)。克隆形成实验结果显示,miRNA-483-5p过表达可以显著促进卵巢癌细胞的克隆形成能力(P<0.001),miRNA-483-5p沉默抑制卵巢癌细胞的克隆形成能力,这一差异并无统计学意义上的显著性。Transwell实验结果显示,miRNA-483-5p过表达可以显著促进卵巢癌细胞的侵袭能力(P<0.01),但miRNA-483-5p沉默抑制卵巢癌细胞的侵袭能力这一结果,没有统计学意义。小结miRNA-483-5p过表达可以促进卵巢癌细胞的活力、增殖、克隆形成能力和侵袭能力,抑制细胞凋亡,对卵巢癌细胞维持基本生物学活动具有重要作用。第三部分miR-483-5p参与卵巢癌化疗耐药的机制目的预测miRNA-483-5p的可能靶基因(RBM5)并进行验证,构建RBM5过表达和沉默卵巢癌细胞株,研究RBM5表达量变化在顺铂压力下对卵巢癌细胞在体外生物学活动(细胞活力、增殖、凋亡、克隆形成能力、侵袭能力)的影响,研究RBM5参与卵巢癌化疗耐药的通路机制,在裸鼠体内验证RBM5对卵巢癌细胞生物学指征和化疗耐药的影响。方法利用生物信息学软件预测miRNA-483-5p调控的靶基因RBM5,并利用双萤光素酶报告基因检测验证靶基因的正确性。利用慢病毒载体和RNA干扰技术构建RBM5过表达和沉默的卵巢癌细胞株,利用CCK-8试剂盒、流式细胞术、克隆形成实验、Transwell实验,研究RBM5表达量变化对顺铂压力下卵巢癌细胞活力、增殖、凋亡、克隆形成能力、侵袭能力等的影响。利用Western blot检测RBM5过表达和沉默卵巢癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路和凋亡相关蛋白的表达水平。通过裸鼠荷瘤实验,比较各组细胞在体内形成肿瘤的能力,以及各组肿瘤在顺铂压力下的敏感性。结果双萤光素酶报告基因检测结果显示,miR-483-5p可以与RBM5基因3,-UTR区结合,说明RBM5是miR-483-5p的靶基因。Western blot结果显示,RBM5过表达卵巢癌细胞中RBM5的相对表达量显著高于RBM5过表达对照组(P<0.001),与RBM5沉默对照组相比,RBM5沉默细胞中RBM5的相对表达量显著降低(P<0.01)。CCK-8实验结果显示,在顺铂压力下,RBM5过表达抑制卵巢癌细胞的活力,RBM5沉默促进卵巢癌细胞的活力。细胞凋亡实验结果显示,在顺铂压力下,RBM5过表达可以显著促进卵巢癌细胞的凋亡(P<0.05),RBM5沉默可以显著抑制卵巢癌细胞的凋亡(P<0.05)。克隆形成实验结果显示,在顺铂压力下,过表达的RBM5可以显著抑制卵巢癌细胞的克隆形成能力(P<0.01),而miR-483-5p可以显著逆转RBM5对细胞克隆能力的抑制作用(P<0.05)。Western blot结果显示,RBM5过表达使Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin和Cyclin D1的相对表达量显著降低(P<0.001),抗凋亡因子Bcl-2的表达显著下调,Bax,cleaved caspase3等促凋亡因子显著上调(P<0.001)。动物实验结果显示,在正常条件下,过表达miRNA-483能够促进卵巢癌肿瘤的生长。顺铂化疗能够有效抑制肿瘤增殖,但是肿瘤细胞过表达miRNA-483后能够显著的提升对顺铂化疗的抵抗。小结RBM5是miR-483-5p的靶基因。在顺铂压力下,RBM5过表达可以抑制卵巢癌细胞的活力、增殖、克隆形成能力和侵袭能力,促进细胞凋亡,而miR-483-5p可以部分逆转RBM5对卵巢癌细胞活动的影响。RBM5过表达抑制β-catenin、Cyclin D1和Bcl-2的表达,促进Bax,cleaved caspase3的上调。过表达miRNA-483能够促进卵巢癌肿瘤的生长。顺铂化疗能够有效抑制肿瘤增殖,但是肿瘤细胞过表达miRNA-483后能够显著的提升对顺铂化疗的抵抗。结论二代测序发现,3个样本间都差异表达的miRNA共有8个,其中miR-483-5p在OC-CR样本中的表达差异最显著。miR-483-5p的高表达与卵巢癌患者的不良预后显著相关。miRNA-483-5p过表达可以促进卵巢癌细胞的活力、增殖、克隆形成能力和侵袭能力,抑制细胞凋亡,对卵巢癌细胞维持基本生物学活动具有重要作用,是参与卵巢癌发展的重要影响因子。RBM5是miR-483-5p的靶基因。在顺铂压力下,RBM5过表达可以抑制卵巢癌细胞的活力、增殖、克隆形成能力和侵袭能力,促进细胞凋亡,而miR-483-5p可以部分逆转RBM5对卵巢癌细胞活动的影响。RBM5过表达抑制β-catenin、Cyclin D1和Bcl-2的表达,促进Bax,cleaved caspase3的上调。过表达miRNA-483能够促进卵巢癌肿瘤的生长。顺铂化疗能够有效抑制肿瘤增殖,但是肿瘤细胞过表达miRNA-483后能够显著的提升对顺铂化疗的抵抗。