少肌症是由增龄而引起的骨骼肌蛋白代谢失衡,造成肌肉功能障碍,行动能力下降。药物、抗阻力运动以及营养干预是预防和治疗少肌症的有效方式。乳脂肪球膜蛋白具有预防和治疗少肌症的作用,但其成分复杂,作用机制尚不明确。本文从乳脂肪球膜蛋白中分离纯化出一种能够促进C₂C₁₂细胞增殖和分化的高丰度蛋白—乳脂肪球表皮生长因子-8（MFG-E8）,系统地研究了MFG-E8的结构、性质、生物学特性,MFG-E8促C₂C₁₂细胞增殖、分化、骨骼肌再生的作用机制,并通过大鼠体内实验进一步并阐明了MFG-E8促进老年少肌症大鼠骨骼肌修复和再生的作用机制。采用DEAE-52纤维素阴离子交换色谱技术,从乳脂肪球膜蛋白中筛选、分离及纯化出一种具有促进C₂C₁₂细胞增殖活性的蛋白组分—MFG-E8,其纯度为98.33%。采用LC-MS/MS、傅里叶红外光谱（FT-IR）、圆二色谱（CD）及生物信息学方法,对MFG-E8的结构和性质进行了分析;MFG-E8由431个氨基酸组成,分子量为47.82 k Da,二级结构以β结构为主（～70%以上）,α-螺旋（～5%）和无规则卷曲（～25%）所占比例较低,其三级结构为不规则球状蛋白;MFG-E8是一种具有疏水腔的亲水性球蛋白,分子内有两个跨膜区域、3个磷酸化位点及2个N-端糖基化位点;根据蛋白质-蛋白质之间相互作用和KEGG Pathway分析,MFG-E8能够参与调节血管生成、凋亡细胞清除、细胞粘附、蛋白质代谢等生物学过程,这些过程主要与ILK/Akt、αvβ6-ERK以及αvβ6/PKC等信号通路有关。MFG-E8促进C₂C₁₂细胞增殖作用与其浓度和作用时间具有显著相关性,200μg/m L MFG-E8对C₂C₁₂细胞作用48 h,细胞增殖率最大（35.8%）;MFG-E8能够降低G0/G1期和S期细胞数量,增加G2/M期细胞数量,促进C₂C₁₂细胞增殖;MFG-E8使C₂C₁₂细胞内线粒体数量增加,为细胞增殖提供能量;MFG-E8上调Myo D、Myo G以及My HC的表达,促进C₂C₁₂细胞融合成多核肌管。基于对C₂C₁₂细胞差异蛋白组分析,MFG-E8可使细胞内8种蛋白质（60S核糖体蛋白L29、NADH脱氢酶、胰岛素降解酶、Hsp40同型蛋白、组蛋白H3、丝/苏氨酸蛋白磷酸酶PGAM5、细胞周期蛋白以及丝/苏氨酸蛋白磷酸酶2A）高表达,这些蛋白质能够介导磷酸脂酰基醇3激酶（PI3K）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、氧化磷酸化以及腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）四种信号通路调控细胞增殖和凋亡过程。q RT-PCR和western blot试验从分子水平证明了MFG-E8促进细胞增殖主要通过介导PI3K和ERK信号通路。MFG-E8能够激活PI3K信号通路,上调Akt的磷酸化表达量,使C₂C₁₂细胞内线粒体数量增加,进而修复损伤C₂C₁₂细胞。基于western blot和q RT-PCR试验证明了MFG-E8能够激活PI3K/Akt信号通路,促进雷帕霉素靶蛋白（m TOR）的ser2448位点磷酸化,上调下游P70S6K磷酸化表达量,最终促进C₂C₁₂细胞增殖。此外,活化的Akt能够上调成肌分化因子（Myo D）、肌细胞生成素（Myo G）以及肌球蛋白重链（My HC）的表达,使C₂C₁₂细胞分化融合形成多核肌管。MFG-E8和乳清浓缩蛋白（WPC）能够降低老年少肌症模型大鼠血清中丙二醛（MDA）、脂褐素、甘油三酯（TG）、非酯化脂肪酸（NEFA）和酮体含量降低,超氧化物歧化酶（SOD）活性和胰岛素生长因子-1（IGF-1）含量提高;腓肠肌纤维横截面积增加、细胞核数量增多、细胞间水肿和腊样变性现象消失,对大鼠腓肠肌具有修复和再生作用。基于q RT-PCR和western blot试验,从分子水平证明了MFG-E8和WPC均能够激活PI3K/Akt信号通路,调节腓肠肌蛋白质代谢过程;MFG-E8通过PI3K/Akt/m TOR/P70S6K信号通路,促进腓肠肌蛋白合成代谢;WPC通过PI3K/Akt/m TOR/4E-BP信号通路,抑制腓肠肌蛋白分解代谢;WPC和MFG-E8协同作用能够增强MFG-E8抑制腓肠肌蛋白分解代谢过程。