随着生活水平的提高,以肥胖、高血压、高血脂和高血糖为主要特征的代谢综合征已经成为影响人类健康的重大挑战。胰岛素抵抗是引起机体代谢紊乱,诱发代谢综合征的重要病理生理基础。近年来研究揭示,相比正常人,妊娠及肥胖个体的肠道微生物组成发生了显著改变,促进了机体慢性低度炎症、氧化应激及胰岛素抵抗的发生,但具体机制尚未完全阐明。膳食纤维是调控肠道微生物的重要因子,有益于肠道微生态稳定。课题组前期创制的功能性纤维对改善母猪肠道微生物组成,提高母猪的繁殖性能具有重要的作用。但尚未探究日粮中添加功能性纤维对母猪胰岛素敏感性的影响,以及这种影响与母猪繁殖性能的关系。另外,功能性纤维在高脂日粮或正常日粮条件下能否改善肥胖个体的胰岛素敏感性?间歇性禁食作为一种有效的肥胖干预手段,联合功能性纤维补充能否进一步提高肥胖个体的胰岛素敏感性?肠道微生物是否协同变化?也值得深入研究。本研究以妊娠母猪为对象,研究功能性纤维能否通过调节肠道微生物影响宿主代谢,改善机体胰岛素敏感性从而提高繁殖性能;以肥胖小鼠为动物模型,研究功能性纤维在高脂日粮或正常日粮条件下,对肥胖个体减肥、机体胰岛素敏感性及肠道各段微生物组成的影响;探索功能性纤维联合间歇性禁食是否对肥胖个体的代谢调节发挥协同作用。主要研究内容和结果如下:第一部分功能性纤维对母猪繁殖性能及围产期胰岛素敏感性的影响本试验研究了妊娠日粮中添加功能性纤维对母猪繁殖性能、围产期胰岛素敏感性、进程性氧化应激以及肠道微生物的影响。99头经产母猪随机分成三组,分别接受功能性纤维添加量为0%(对照组)、1%(试验1组)以及2%(试验2组)的妊娠日粮,喂料量保持一致,度量母猪繁殖性能。在妊娠第109 d及泌乳第3 d进行餐试验,在妊娠第110 d及泌乳第4 d进行葡萄糖耐受试验(glucose tolerance test,GTT);采集妊娠第30 d、60 d、90 d、109 d、分娩当天及泌乳第3 d、7 d、21 d晨饲后2 h血浆样品,检测氧化应激指标;采集妊娠第30 d、60 d、109 d及泌乳第3 d粪便样品,检测相关特异性菌群丰度。主要结果如下:1.相比对照组,试验1组和2组母猪繁殖周期的体重及背膘厚度无显著差异(P>0.05);试验1组和2组母猪总产仔数、产活仔数及仔猪初生窝重无显著差异(P>0.05),但仔猪初生个体重极显著增加(P<0.01),弱仔率(<800g,%)极显著降低(P<0.01)。在泌乳期带仔数一致的条件下,相比对照组,试验1组和2组母猪泌乳期采食量、断奶至发情间隔天数无显著差异(P>0.05),但试验1组仔猪哺乳期平均日增重以及断奶个体重显著增加(P<0.05),试验2组仔猪生长性能无显著差异(P>0.05)。以上结果说明,妊娠日粮中添加功能性纤维提高了母猪的产仔性能,1%添加比例促进仔猪哺乳期生长。2.相比对照组,试验2组母猪妊娠第109 d及泌乳第3 d餐试验葡萄糖曲线下面积(area under curve,AUC)极显著降低(P<0.01),妊娠第110 d GTT中葡萄糖AUC显著降低(P<0.05),表明围产期胰岛素敏感性提高。3.相比对照组,试验1组和2组母猪分娩当天血浆中丙二醛以及妊娠107d血浆中8-羟基脱氧鸟苷水平显著降低(P<0.05),泌乳第7d血浆中总超氧化物歧化酶水平极显著增加(P<0.01);试验1组分娩当天仔猪脐带血浆中活性氧水平极显著增加(P<0.01),表明妊娠日粮中添加功能性纤维缓解了母猪围产期氧化应激。4.相比对照组,试验1组和2组母猪妊娠第109 d粪便中产气荚膜梭菌丰度极显著减少(P<0.01),试验1组妊娠第60 d、109 d粪便中大肠杆菌数量显著增加(P<0.05);试验2组妊娠第109 d粪便中乳酸杆菌属丰度最高(P<0.05),表明功能性纤维添加增加了母猪妊娠中后期肠道中有益微生物丰度而减少有害微生物丰度。第二部分功能性纤维对高脂日粮诱导的肥胖小鼠体重及胰岛素敏感性的影响本试验研究了日粮添加功能性纤维对肥胖小鼠体重、体脂、糖脂代谢、系统性炎症、肠道屏障及肠道微生物组成及代谢的影响。110只4-5周龄C57BL/6雄性小鼠经高脂日粮饲喂10周后获得42只肥胖小鼠,根据体重相近原则选取21只,随机分为3组,分别为高脂日粮饲喂的负对照组、高脂日粮中分别添加功能性纤维4%的试验1组和6%的试验2组;以同批低脂日粮饲喂的7只正常小鼠为正对照组。所有肥胖小鼠接受高脂日粮饲喂12周期(6天/周期)(P1阶段)后转为普通日粮饲喂4周期(P2阶段);正对照组小鼠P1阶段饲喂低脂日粮,P2阶段饲喂普通日粮。每周期记录每只小鼠体重,每日记录采食量。在P2阶段第2周期,采集餐后2 h血清,分析饱感激素肽YY(peptide yy,PYY)、胰岛血糖素样肽1(glucagon-like peptide 1,GLP-1)浓度。在P1阶段第12周期和P2阶段第4周期,采集空腹血清,分析所有样品中血脂组成和P2阶段血清中炎性因子水平。采血两天后进行GTT及胰岛素耐受试验(insulin tolerance test,ITT)。收集P1及P2阶段末期的粪便样品,利用16S rRNA测序技术分析各样品微生物组成情况,利用气相色谱法测定短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)浓度。试验结束时处死小鼠,H&E染色观察结肠及附睾白色脂肪组织形态学变化,Brd U染色观察结肠细胞更新情况,油红O染色度量肝脂含量;RT-PCR度量结肠紧密连接蛋白基因m RNA的表达。主要结果如下:1.在P1阶段,试验1组和2组小鼠的体重及能量摄入量与负对照组无显著差异(P>0.05),极显著高于正对照组(P<0.01);在P2阶段,试验1组和2组的体重及能量摄入量极显著低于负对照组,仍高于正对照组(P<0.01),且小鼠餐后血清中PYY、GLP-1浓度极显著高于负对照组(P<0.01)。试验结束时,试验1组和2组小鼠Lee’s指数、各皮下及内脏白色脂肪垫重量、附睾白色脂肪细胞面积、肝脂含量等肥胖相关指标显著低于负对照组(P<0.05),与正对照组无显著差异(P>0.05)。上述结果表明,功能性纤维在普通日粮中添加提高了肥胖小鼠餐后饱感激素水平,减少能量摄入,促进体重降低,而在高脂日粮中添加无此效果。2.在P1阶段,各组间血清甘油三酯、游离脂肪酸、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇无显著差异(P>0.05)。在P2阶段,试验1组和2组LDL-C浓度显著低于负对照组(P<0.05),与正对照组无显著差异(P>0.05);而高密度脂蛋白胆固醇浓度极显著高于正、负对照组(P<0.01)。在P1阶段,试验2组ITT葡萄糖AUC显著低于负对照组(P<0.05),与正对照组无显著差异(P>0.05);试验1组与正对照组和负对照组无显著差异(P>0.05)。P2阶段,试验1组和2组空腹6 h血糖水平、ITT葡萄糖AUC均显著低于正对照组和负对照组(P<0.05)。上述结果表明,6%功能性纤维在高脂和普通日粮中添加均能提高肥胖小鼠胰岛素敏感性,在普通日粮中添加改善脂代谢。3.试验1组和2组结肠粘膜层厚度极显著高于负对照组(P<0.01),但与正对照组无显著差异(P>0.05);试验2组隐窝深度极显著高于正对照组和负对照组(P<0.05)。试验1组和2组结肠孔通道形成蛋白Claudin-2基因m RNA表达量显著低于负对照组(P<0.05),而与正对照组无显著差异(P>0.05);试验2组紧密连接蛋白ZO-1基因m RNA表达量(P<0.05)及结肠Brd U阳性染色细胞数量(P<0.05)显著高于负对照组,而与正对照组无显著差异(P>0.05)。系统性炎症指标检测发现,试验1组和2组血清中脂联素浓度极显著高于正对照组和负对照组(P<0.01),瘦素浓度极显著低于负对照组(P<0.01),与正对照组无显著差异(P>0.05);试验2组血清中肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6及脂多糖浓度极显著低于负对照组(P<0.01),极显著高于正对照组(P<0.01)。上述结果表明,6%的功能性纤维改善了肥胖小鼠的肠道屏障功能,缓解了系统性炎症。4.粪便SCFAs测定结果显示,在P1阶段,试验1组粪便中丁酸、异丁酸、异戊酸含量(P<0.05)以及试验2组粪便中丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸、异戊酸含量均显著低于负对照组(P<0.05),与正对照组无显著差异(P>0.05)。在P2阶段,试验1组粪便中各SCFAs与正对照组和负对照组无显著差异(P>0.05),试验2组粪便中乙酸、丙酸和总SCFAs的含量显著高于正对照组和负对照组(P<0.05)。5.在P1及P2阶段,负对照组粪便中总微生物数量及α多样性与正对照组无显著差异(P>0.05),但厚壁菌门/拟杆菌门(F/B)比值显著高于正对照组(P<0.05),Ruminococcus、Dorea及Oscillospira等产SCFAs菌显著高于正对照组(P<0.05),共生有益菌Allobaculum及S24-7显著低于正对照组(P<0.05)。在P1阶段,试验2组粪便总微生物数量及α多样性与负对照组无显著差异(P>0.05),F/B比值显著低于负对照组(P<0.05);在P2阶段,试验2组总微生物数量显著高于负对照组(P<0.05),Allobaculum及S24-7(与体重和胰岛素抵抗显著负相关)显著高于负对照组(P<0.05),而粘液消耗菌Ruminococcus(瘤胃球菌属)、Oscillospira(颤螺菌属)、Dehalobacterium(低嗜盐菌属)、Strptococcus(链球菌属)、Desulfovibrio(脱硫弧菌属)等(与体重和胰岛素抵抗显著正相关)显著低于负对照组(P<0.05)。上述结果说明,6%功能性纤维改变肥胖小鼠粪便微生物组成。第三部分功能性纤维对高脂日粮诱导的肥胖小鼠不同肠段微生物组成变化的影响试验结束时,采集第二部分试验小鼠十二指肠、回肠、盲肠及结肠内容物样品及粪便样品,利用16S rRNA测序技术分析各肠段样品中微生物组成情况。主要结果如下:1.所有试验小鼠的后肠段(盲肠、结肠)及粪便微生物组成中门和属的分类数减少,观测OTU数、Chao1指数显著高于前肠段(十二指肠、回肠)(P<0.01),β多样性在前肠段和后肠断间具有显著差异(P<0.01);厚壁菌门、变形菌门分别在回肠及盲肠段相对丰度最高(P<0.01),拟杆菌门在盲肠段相对丰度最低(P<0.01)。2.主坐标分析(principal coordinate analysis,PCo A)结果显示,正对照组中十二指肠与回肠间微生物组成无显著差异(P>0.05),回肠、盲肠、结肠及粪便之间微生物组成差异显著(P<0.01),个体间微生物组成在回肠段差异最大、在结肠段最相似;负对照组中十二指肠、回肠及盲肠间微生物组成差异显著(P<0.01)。相邻肠段差异菌属分析显示,负对照组回肠中Parabacteroides(副拟杆菌)、Lactobacillus(乳杆菌属)、Faecalibacterium等有益菌显著低于十二指肠(P<0.05);盲肠中Staphylococcus(葡萄球菌属)、Streptococcus(链球菌属)、Ochrobactrum(苍白杆菌属)、Serratia(沙雷氏菌属)等有害菌显著低于回肠(P<0.05)。相比正对照组,负对照组各肠段微生物α多样性无显著差异(P>0.05),十二指肠、回肠、结肠及粪便微生物β多样性显著差异(P<0.05),粪便中变形菌门相对丰度显著增加(P<0.05)。以上结果说明,高脂日粮引起前肠段微生物组成显著变化。4.试验2组的PCo A分析结果显示,前肠段和后肠段微生物结构差异显著(P<0.05)。相邻肠段差异菌属分析发现,盲肠中Mucispirillum、Prevotella(普氏菌属)、Bacteroides(拟杆菌属)、Allobaculum等多种碳水化合物代谢相关菌丰度显著高于回肠(P<0.05),结肠中Coprococcus(粪球菌属)、Oscillospira(颤螺菌属)、Ruminococcus(瘤胃球菌属)等厚壁菌门碳水化合物代谢相关菌以及有害菌Desulfovibrio(脱硫弧菌属)显著低于盲肠(P<0.05)。试验2组全肠段α多样性与负对照组无显著差异(P>0.05),微生物β多样性在盲肠、结肠及粪便与负对照组具有显著差异(P<0.05),结肠及粪便中厚壁菌门显著低于负对照组(P<0.05),粪便中放线菌门显著高于负对照组(P<0.05)。以上结果说明,6%功能性纤维从盲肠开始促进后肠段微生物组成变化,选择性富集纤维酵解菌。第四部分功能性纤维联合间歇性禁食对高脂日粮诱导肥胖小鼠胰岛素敏感性的影响在第二部分试验中获得的42只肥胖小鼠中,根据体重相近原则挑选21只肥胖小鼠随机分为3组:分别为高脂日粮隔天禁食组(对照组2)、隔天禁食+高脂日粮添加4%功能性纤维组(试验1组)以及隔天禁食+高脂日粮添加6%功能性纤维组(试验2组)。以第二部分试验负对照组为高脂日粮自由采食组(对照组1)。所有小鼠接受高脂日粮饲喂12周期(6天/周期)(P1阶段)后转为普通日粮饲喂4周期(P2阶段),探究隔天禁食+功能性纤维组合模式对肥胖小鼠体重、体脂、糖脂代谢、肠道屏障、粪便SCFAs及微生物组成的影响。主要结果如下:1.隔天禁食组(对照组2、试验1组和2组)小鼠在P1及P2阶段的能量摄入量及体重,以及试验结束时小鼠Lee’s指数、各皮下及内脏白色脂肪垫重量、附睾白色脂肪细胞面积及肝脂含量等肥胖相关指标均极显著低于自由采食组(对照组1)(P<0.05)。相比对照组2,在P1阶段,试验1组和2组的能量摄入量及体重无显著差异(P>0.05),但在P2阶段试验2组极显著降低(P<0.01)。相比对照组2,试验2组小鼠P2阶段餐后血液中PYY浓度显著增加(P<0.05),进食当天采食量显著降低(P<0.05)。上述结果说明,隔天禁食显著减少肥胖小鼠能量摄入量,降低肥胖;6%功能性纤维在普通日粮中添加协同增强隔天禁食小鼠的摄食饱感,进一步减少能量摄入和体重,而高脂日粮中添加无此效果。2.P1阶段,试验1组和2组小鼠血清中甘油三酯、LDL-C浓度极显著低于对照组1(P<0.01),与对照组2无显著差异(P>0.05);P2阶段,试验1组和2组小鼠血清中LDL-C浓度显著低于对照组1(P<0.01),与对照组2无显著差异(P>0.05)。P1阶段,试验1组ITT葡萄糖AUC极显著低于对照组1(P<0.01),与对照组2无显著差异(P>0.05),试验2组极显著低于对照组1和对照组2(P<0.01);P2阶段,试验1组和2组ITT葡萄糖AUC极显著低于对照组1和对照组2(P<0.01)。上述结果表明,隔天禁食促进脂质代谢,提高胰岛素敏感性,在高脂及普通日粮中添加6%功能性纤维进一步增强了隔天禁食小鼠的胰岛素敏感性。3.结肠组织形态学测定结果显示,各组间结肠粘膜层厚度、隐窝深度、紧密连接相关蛋白基因m RNA表达量无显著差异(P>0.05),但对照组2、试验1组和试验2组结肠Brd U阳性染色细胞的数量极显著高于对照组1(P<0.01),且试验2组极显著高于对照组2(P<0.01),表明隔天禁食促进肠道细胞更新,6%功能性纤维加强了这一作用。4.相比对照组1,对照组2和试验1组附睾白色脂肪组织产热相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活剂1-α(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha,Pgc1α)m RNA表达量显著增加(P<0.05),试验2组Pgc1α及II型碘甲状腺原氨酸脱碘酶(Type II iodothyronine deiodinase,Dio2)m RNA表达量显著增加(P<0.05);相比对照组2,试验2组Dio2的m RNA表达量显著增加(P<0.05),这表明隔天禁食与功能性纤维在脂肪细胞产热中可能发挥重要的促进作用。5.SCFAs测定结果显示,在P1阶段,对照组2粪便中乙酸、丙酸、丁酸、戊酸及异戊酸及总SCFAs浓度极显著低于对照组1(P<0.01),试验1组和2组各SCFA浓度与对照组2无显著差异(P>0.05);在P2阶段对照组2各SCFA浓度与对照组1无显著差异(P>0.05),试验1组粪便中乙酸浓度以及试验2组粪便中乙酸、丁酸及总SCFAs浓度显著高于对照组2(P<0.05)。以上结果表明,隔天禁食降低了高脂日粮饲喂阶段肥胖小鼠肠道中SCFAs的生产;功能性纤维补充增加了普通日粮饲喂阶段肠道中SCFAs的生产。6.在P1及P2阶段,与对照组1相比,对照组2粪便总微生物数量及α多样性无显著差异(P>0.05),但β多样性具有显著差异(P<0.05);在P1阶段有益菌Lactobacillus(乳杆菌属)及S24-7科显著高于对照组1(P<0.05),在P2阶段Lactobacillus(乳杆菌属)、Paraprevotella(帕拉普氏菌属)等益生菌显著高于对照组1(P<0.05),而葡萄球菌属、螺杆菌属、脱硫弧菌属等潜在有害菌显著低于对照组1(P<0.05)。试验2组P1及P2阶段粪便总微生物数量与对照组2无显著差异(P>0.05),但是P2阶段的微生物α多样性极显著高于对照组2(P<0.01),F/B比值极显著低于对照组2(P<0.01)。试验2组的S24-7、Lactobacillus、Bifidobacterium(双歧杆菌属)显著高于对照组1(P<0.05),与对照组2无显著差异(P>0.05)。相关性分析表明,S24-7、Lactobacillus、Bifidobacterium与小鼠肥胖及胰岛素抵抗显著负相关(P<0.05)。上述结果表明,功能性纤维联合隔天禁食禁食可能通过协同促进肠道中有益菌富集,提高胰岛素敏感性。综上所述,本研究的主要结论如下:(1)功能性纤维通过提高围产期母猪胰岛素敏感性,改善繁殖性能;在高脂日粮及普通日粮下均能提高肥胖小鼠胰岛素敏感性,但在高脂日粮下无减肥效果。(2)功能性纤维从盲肠段开始选择性富集肠道中纤维代谢相关菌,改善肠道屏障功能,缓解LPS驱动的系统性炎症。(3)隔天禁食联合功能性纤维减少肥胖小鼠能量摄入量,降低肥胖,促进肠道中益菌Lactobacillus、Bifidobacterium、S24-7富集,改善机体胰岛素敏感性。