七叶皂苷钠对大鼠脊髓半横断损伤区域自噬分子Beclin-1的影响

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目的观察七叶皂苷钠对脊髓半横断大鼠脊髓损伤区域Beclin-1蛋白的表达变化。探讨七叶皂苷钠改善脊髓半横断大鼠神经功能恢复的机制。方法选取89只成年雌性SD大鼠,进行随机分组:假手术组(A组)9只,只切开椎板;生理盐水组(B组),七叶皂苷钠组(C组)各40只。B、C两组在腰23(L23)脊髓段建立稳定的左侧半横断损伤模型。B、C组分别在造模前30min经腹腔注射1.5ml生理盐水与1.5ml七叶皂苷钠液(6mg/Kg用生理盐水溶解)。在造模前,造模后第6h、1d、3d、7d以及14d分别对各组大鼠后肢进行运动功能评分(BBB评分)。根据上述时间点对B、C两组分别取材,以损伤点为中心,将腰23(L23)脊髓段长约1.5cm的损伤区域取出,用于HE染色,观察脊髓神经细胞形态;用于免疫组化进行定性、定量分析;使用Western-blot免疫印迹法检测大鼠脊髓损伤区域Beclin-1蛋白的表达。所有数据采用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析;所有计量资料均以平均值±标准误(x±s)来表示,使用独立样本t检验以及单因素方差分析(analysis of variance,ANOV)进行统计学检验,凡P<0.05,差异有统计学意义。结果1,脊髓神经功能评分(BBB评分):B、C两组造模后1d内左后肢运动功能消失;组内比较,在第3d后BBB评分改善,差异存在统计学意义(P<0.05);相同时间点,B、C两组组间比较:在造模后第7d后,C组BBB评分均高于B组,差异存在统计学意义(P<0.05)。2,HE染色:A组脊髓组织中神经元及胶质细胞形态结构完整,无水肿,细胞坏死。B、C两组比较发现:C组损伤区域中神经元破坏较B组轻,且部分神经元保存完整,胶质细胞增多。3,免疫组化Beliin-1阳性细胞表达:Beclin-1表达主要定位在脊髓损伤区域的胞浆与核膜,在细胞间质、轴突以及胞核轻微表达或者不表达。A组中脊髓损伤区域中有少量Beclin-1棕黄色颗粒表达,分布较疏松,呈低弱阳性表达。损伤组中Beclin-1表达主要分布在hSCI损伤区域,非损伤区域边缘较少。损伤组中棕黄色颗粒表达较多,分布较密集,呈强阳性表达。B、C两组组内比较:第14d的Beclin-1阳性细胞数低于第3d的Beclin-1阳性细胞数,差异有统计学意义(P<0.01)。相同时间点,B、C两组组间比较:第3d与第14d中的Beclin-1阳性细胞数比较:C组Beclin-1阳性颗粒数较B组均明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。4,Western blot检测hSCI区域Beclin-1蛋白表达:B、C两组Beclin-1蛋白在造模后6h开始升高,造模后第3d达峰值,第7d开始降低,第14d最低。不同时间点,B、C两组组内比较:在第3d及以后时间点的灰度值比较,差异存在统计学意义(P<0.05)。相同时间点,B、C两组组间比较:在第3d及以后时间点灰度值比较,C组均高于B组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论1,在正常大鼠的脊髓中存在自噬低表达;hSCI后自噬表达增强;2,在大鼠hSCI模型中,七叶皂苷钠可增强自噬相关蛋白Beclin-1的表达;3,基于本研究发现推得七叶皂苷钠调节自噬相关蛋白Beclin-1表达,同时可改善脊髓损伤后大鼠神经功能BBB评分。
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