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中脑多巴胺（DA）奖赏环路系统由中脑腹侧被盖区及其投射靶区伏隔核、前额叶皮层和杏仁核等组成。该奖赏系统可以参与与奖赏有关的抑郁及药物成瘾,也可以参与与奖赏无关的行为,如疼痛和厌恶等。中脑VTA投射到不同部位的DA能神经元在解剖分布、电生理特性和行为学相关性方面具有异质性。在电生理特性方面,投射到不同靶区的DA能神经元在放电频率、动作电位时程、Ih电流大小和D2R-GIRK调节机制参与程度等方面有所不同。这些投射特异性相关的异质性,更加体现了针对性研究VTA DA能神经元亚群的重要性。VTA DA能神经元主要有tonic（基础张力）放电和burst（簇型）两种自发放电模式,这些DA能神经元的放电模式可以影响DA的释放及与VTA区相关的动物行为。有研究发现,反复社交失败压力刺激下,小鼠VTA区DA能神经元的burst放电增加会引起DA释放增多,诱发小鼠的抑郁样行为。VTA区DA能神经元的兴奋性可以被众多膜受体（GABA受体和NMDA受体）和离子通道（钙激活钾通道,Kv7通道,G蛋白偶联内向整流钾通道）所调节。其中的钾离子通道是调节VTA区DA神经元兴奋性的重要因素之一,也是神经元兴奋性产生和传递的基础。DA介导的自抑制作用是调节DA神经元兴奋性的重要机制。VTA区胞体树突通过释放DA激活自身D2受体进而影响神经元的兴奋性,DA通过D2受体和与Gαi/o蛋白相连的Kir3/GIRK家族的K+通道起作用,引起细胞膜超级化,抑制神经元的兴奋性。最近的研究表明,D2R-Kir3/GIRK调节通路在投射到不同靶区的VTA DA神经元上的的表达不一样。调节VTA区DA神经元的兴奋性的另一个重要的K+通道家族是Kv7/KCNQ通道。Kv7/KCNQ通道中的Kv7.2-7.5在中枢神经系统中都有表达。开放Kv7通道会使细胞膜超级化,抑制神经元的兴奋性。Kv7家族中的Kv7.4亚型选择性表达在VTA DA能神经元上。有研究发现,Kv7通道可以作为一些疾病的治疗靶点,如疼痛、癫痫、焦虑和药物成瘾等。在人们熟知的D2R-Kir3/GIRK通路外,特别是GIRK通道表达较低的神经元上,Kv7通道是另一个影响VTA区DA神经元兴奋性的机制。本研究主要探讨Kv7.4和Kir3.2通道在调控投射到NAc和BLA的VTA区DA能神经元兴奋性中的作用。第一部分投射到不同脑区的VTA区多巴胺能神经元的异质性目的:观察投射到不同脑区的VTA区DA能神经元的异质性方法:利用逆行性示踪和免疫组化技术,确定投射到各脑区的DA能神经元在VTA区的分布;利用电生理贴附式膜片钳技术,研究VTA的各投射靶区的多巴胺能神经元电生理特性的差异;利用单细胞PCR技术,观察投射到不同脑区的VTA DA能神经元标识物的不同,以及Kv7.4和Kir3.2离子通道在VTA DA能神经元的表达。结果:（1）投射到各个脑区的多巴胺能神经元在VTA的分布:免疫组织共染结果表明,投射到NAc的VTA DA能神经元主要分布在内侧黑质旁核（PN）和臂旁色素核（PBP）核,投射到mPFC的VTA DA神经元主要位于靠近中线的束间核（IF）,而投射到BLA的VTA DA神经元在整个臂旁色素核散在分布。投射到NAc和BLA的VTA神经元绝大多数存在逆行性示踪剂与TH抗体的共标,表明投射到这两个脑区的神经元大部分是多巴胺能神经元。（2）不同靶向投射的多巴胺能神经元的电生理差异:野生型小鼠中,投射到NAc和BLA的VTA DA神经元的放电频率低于投射到mPFC的VTA DA神经元的放电频率（P<0.05）。投射到NAc的动作电位时程,明显短于投射到mPFC的动作电位时程（P<0.05）。（3）DA和baclofen对VTA投射到各个靶区的多巴胺能神经元兴奋性的影响:用细胞贴附式记录结果表明,DA（20μM）能抑制投射到NAc和BLA的多巴胺能神经元的放电（P<0.05）,而对投射到mPFC的神经元放电频率没有影响（P>0.05）;应用baclofen（10μM）后,各投射靶区（NAc core,mPFC和BLA）的多巴胺能神经元放电频率明显小于给药前的放电频率（P<0.05）。（4）单细胞PCR结果:投射到NAc和BLA中80%–95%的神经元表达TH和DAT mRNA,大多数是多巴胺能神经元。相比之下,投射到mPFC小于30%的神经元表达TH,但是没有DAT表达。D2受体的mRNA在投射到NAc（82%）和BLA（62%）的VTA DA神经元上高表达,而在投射到mPFC的VTA DA神经元没有表达。投射到三个脑区的VTA神经元中,大约50%-70%有Kv7.4的表达,相应的在60%90%神经元中有明显的Kir3.2通道的表达。结论:（1）投射到NAc和BLA的VTA DA神经元的放电频率低于投射到mPFC的VTA DA神经元的放电频率。（2）DA可以抑制投射至NAc和BLA的VTA DA能神经元的兴奋性,对投射至mPFC的神经元没有作用。（3）Kir3.2和Kv7.4在投射至各靶区的VTA DA神经元中的表达没有不同,多巴胺能标记物TH、DAT和D2在投射至NAc和BLA的神经元上大量表达,而在投射至mPFC的神经元上表达明显减少。第二部分Kv7.4和Kir3.2通道在VTA-NAc投射通路中DA能神经元的自抑制中的作用目的:观察Kv7.4和Kir3.2通道在VTA-NAc投射通路中DA能神经元兴奋性调控中的作用方法:利用mRNA原位杂交和免疫荧光技术,观察Kv7.4和Kir3.2在VTA区的表达;利用离体脑片膜片钳贴附和全细胞记录技术,观察野生型小鼠、Kv7.4-/-鼠、Kir3.2-/-鼠和Kv7.4-/-/Kir3.2-/-小鼠中,调控Kv7.4和Kir3.2功能对VTA-NAc投射通路中VTA DA能神经元兴奋性的影响。结果:（1）原位杂交和免疫组合结果显示,VTA区TH抗体免疫阳性神经元中均有Kv7.4和Kir3.2通道的表达。（2）Kv7.4和Kir3.2通道对VTA投射到NAc的神经元中DA引起的自抑制作用的影响:DA（20μM）显著降低VTA DA神经元在野生型小鼠（P<0.05）,Kv7.4-/-小鼠（P<0.05）、Kir3.2-/-小鼠（P<0.05）和Kv7.4-/-/Kir3.2-/-（P<0.05）小鼠上VTA-NAc投射通路中的平均放电频率。野生型小鼠中,DA诱导的自抑制作用大多数可以被XE991逆转（P<0.05）;在Kv7.4-/-小鼠中,XE991不能显著逆转DA的自抑制作用;在Kir3.2-/-小鼠中,XE991可部分翻转DA的作用（P<0.05）。Tertiapin-Q能部分阻断野生型（P<0.05）和Kv7.4-/-小鼠（P<0.05）中DA引起的自抑制作用,但是在Kir3.2-/-小鼠中没有明显作用（P>0.05）。野生型小鼠中83%（19/23）的神经元,Kv7.4-/-小鼠中71%（17/24）的神经元和Kir3.2-/-小鼠中43%（10/23）和Kv7.4-/-/Kir3.2-/-小鼠中20%（2/10）的神经元的放电可被DA完全抑制。（3）DA可以激活神经元的Kv7/M和Kir3/GIRK电流:野生型小鼠中,DA（20μM）使M样电流从71.0±13.6 pA增大至93.0±15.1 pA（P<0.05）;XE911（3μM）使M样电流从93.0±15.1 pA降低至39.0±7.1 pA（P<0.05）,而在Kv7.4-/-小鼠中,XE991增大M样电流的作用消失。同样,tertiapin-Q可以阻断野生型小鼠上DA引起的Kir3/GIRK电流（P<0.05）,而在Kir3.2-/-小鼠上给予DA后Kir3/GIRK电流无明显增加（P>0.05）。结论:（1）Kv7.4及Kir3.2通道在VTA-NAc投射通路中DA能神经元的自抑制中发挥重要作用,共同构成其自抑制作用的机制。（2）除了Kv7.4和Kir3.2通道外,还有其他离子机制参与VTA DA神经元兴奋性的自调节作用。第三部分Kv7.4和Kir3.2通道在VTA-BLA投射通路中DA能神经元的自抑制中的作用目的:观察Kv7.4和Kir3.2通道在VTA-BLA投射通路中对DA能神经元兴奋性调控中的作用方法:利用离体脑片膜片钳贴附和全细胞记录技术,观察野生型小鼠、Kv7.4-/-和Kir3.2-/-小鼠中,调控Kv7.4和Kir3.2功能对VTA-BLA投射通路中VTA DA能神经元兴奋性的影响。结果:（1）Kv7.4和Kir3.2对VTA投射到BLA的神经元中DA引起的自抑制作用的影响:同第二部分结果类似,应用DA（20μM）后,VTA-BLA投射通路中DA神经元的平均放电频率在野生型小鼠（P<0.05）,Kv7.4-/-小鼠（P<0.05）和Kir3.2-/-小鼠（P<0.05）上能够显著降低。野生型小鼠中,XE991可以逆转大多数神经元中DA诱导的自抑制作用（P<0.05）;Kv7.4-/-小鼠中,DA的自抑制作用不能被XE991显著逆转;Kir3.2-/-小鼠中,XE991可部分翻转DA的作用（P<0.05）。用同样的方法,tertiapin-Q代替XE991,结果显示tertiapin-Q能部分阻断野生型（P<0.05）和Kv7.4-/-小鼠（P<0.05）中DA引起的自抑制作用,但是在Kir3.2-/-小鼠中没有明显作用（P>0.05）。（2）DA可以激活VTA-BLA投射通路中DA能神经元的Kv7.4/M和Kir3.2/GIRK电流:在野生型小鼠VTA区域的DA神经元中,DA（20μM）使M样电流从58.8±10.3 pA增大至85.0±9.4 pA（P<0.05）;XE911（3μM）使M样电流从85.0±9.4 pA降低至33.8±4.3 pA（P<0.05）,而在Kv7.4-/-小鼠中,DA增大M样电流的作用消失（67.5±8.8 p A至71.8±10.8 pA）。同样,tertiapin-Q（300 nM）可以阻断野生型小鼠上DA引起的Kir3/GIRK电流（-286.3±55.4 pA降低至-207.5±50.6 pA,P<0.05）,而在Kir3.2-/-小鼠上DA没有作用（-225±26.0 p A至-240±31.8 pA,P>0.05）。结论:Kv7.4及Kir3.2通道在VTA-BLA投射通路中DA能神经元的自抑制中发挥重要作用,共同构成其自抑制作用的机制。