马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi ssp.zooepidemicus,SEZ）属兰氏分群的C群β溶血链球菌,可引起败血症,关节炎,心内膜炎和脑膜炎。其宿主谱较广,可感染猪、马、犬、猫等多种与人类关系密切的动物。在我国,SEZ是造成猪链球菌病的重要猪源病原体,是引起猪细菌性脑膜炎的主要病原之一。同时,全球范围内已有大量人类感染SEZ引起脑膜炎的病例报道,大多数感染与密切接触患病动物或食用被污染的食物有关,严重时可导致死亡。因此,SEZ人畜共感染和致脑膜炎的特性已对人类健康构成巨大威胁。本文对PurC影响马链球菌兽疫亚种ATCC35246株致脑膜炎相关机制进行了研究。并且筛选了其他可能破坏血脑屏障的SEZ分泌蛋白。以上研究结果为进一步阐明SEZ引起脑膜炎的机制提供理论依据。1、马链球菌兽疫亚种PurC与HEK 293T细胞互作蛋白的筛选PurC（磷酰基氨基咪唑-琥珀酰基酰胺合成酶,SAICAR合成酶）为参与嘌呤生物合成途径第七步的催化酶。课题组前期对SEZ ATCC35246强毒株的全基因组进行比较基因组学分析,在其II号毒力岛中发现了 SEZ ATCC35246特有的purC基因。本研究通过 SILAC（stable isotope labeling by amino acids in cell culture）及 LC-MS/MS 筛选HEK 293T细胞中可能与PurC有相互作用的蛋白。首先通过SILAC标记获得Arg13C6,Lys13C6 标记的重标 HEK 293T 细胞和 Arg12C6,Lys12C6 标记的轻标 HEK 293T细胞,随后构建SEZ PurC真核表达载体purC-pAcGFP并转染重标HEK 293T细胞,同时用空载pAcGFP质粒转染轻标HEK 293T细胞,两组细胞总蛋白经1:1等量混合后,Co-IP（co-immunoprecipitation）富集结合蛋白。两次重复共检测到差异蛋白19个。经 Co-IP 及 western blot 进一步验证确定 PurC 与 Ezrin、CIP4、Elmod2 互作。2、PurC通过调节脑内皮细胞Moesin磷酸化破坏血脑屏障脑膜炎是SEZ感染的人和动物的主要症状。SEZ必须突破血脑屏障（Blood-brain barrier,BBB）并且逃避宿主免疫防御感染脑组织引起脑膜炎。本研究证明PurC为一种SEZ分泌的毒力因子,它可以进入人脑微血管内皮细胞（human brain microvascular endothelial cells,hBMEC）,并影响细胞骨架。前期筛选结果表明,Ezrin可能与PurC存在互作。Ezrin属于ERM蛋白家族,该家族蛋白具有组织表达差异性,在内皮细胞中主要表达形式为Moesin,因此我们通过Co-IP及SPR（surface plasmon resonance）证明Moesin与PurC互作。并进一步确认PurC的Ficdomain与Moesin的C-ERMAD结合。Moesin在非活化状态下,C-ERMAD结构域与N-端FERM结构域紧密结合。当C-ERMAD的Thr558被磷酸化时,FERM从C-ERMAD解离,使Moesin转变为活化态的p-Moesin。结果表明,PurC与活化态Moesin具有更高的结合能力,并且可以维持细胞中Moesin的磷酸化水平。p-Moesin通过N-末端结构域（FERM）与跨膜蛋白结合,C-末端结构域（C-ERMAD）与肌动蛋白（F-actin）骨架结合来调节细胞骨架结构。除了作为与细胞粘附分子相互作用的膜-细胞骨架连接分子之外,Moesin还调节鸟苷三磷酸酶（Rho GTPase）家族活性,如RhoA。Dbl为直接负责RhoA激活的GEF因子。PurC处理后,细胞中Moesin磷酸化结合RhoEGF-Dbl导致RhoA活化。随后细胞内产生大量应力纤维,细胞骨架紊乱,最终破坏血脑屏障完整性。3、PurC影响中性粒细胞跨血脑屏障迁移的机制炎症是机体面对病原菌侵袭的一种防御性反应,但是过度的免疫反应可造成严重的炎性损伤。细菌性脑膜炎是中枢神经系统常见的感染。血液中细菌须穿透主要由脑微血管内皮细胞（BMECs）组成的血脑屏障（BBB）而进入中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）,细菌产生的毒素和机体免疫应答产生的炎症也会引起组织损伤,特别是中性粒细胞（polymorphonuclearneutrophil,PMNs）的过度炎症反应与CNS损伤密切相关。已知ERM蛋白在中性粒细胞迁移过程中扮演重要角色。本研究证明PurC能够与中性粒细胞Ezrin互作,并且使细胞中Ezrin Thr567磷酸化水平显著升高。磷酸化的Ezrin能够结合Dbl活化Rac1,引起细胞内F-actin聚集,使细胞产生尾足。同时,磷酸化的Ezrin能够将选择蛋白受体CD44和PSGL-1募集在细胞尾足部位,以促进其与内皮细胞表面选择蛋白结合,进而引起大量的中性粒细胞穿透血脑屏障。4、SEZ与mBMEC互作分泌蛋白的筛选SEZ会引起人和动物的脑膜炎。本研究发现SEZ的分泌蛋白对小鼠脑微血管内皮细胞（mBMEC）具有细胞毒性,并可能促进SEZ穿过血脑屏障（BBB）。运用SILAC标记获得Arg13C6,Lys13C6标记的重标SEZ和Arg12C6,Lys12C6标记的轻标SEZ。通过LC-MS/MS检测,筛选到与小鼠脑微血管内皮细胞（mBMECs）相互作用的SEZ分泌蛋白。质谱结果共鉴定出49种有效的肽,与可以匹配25种SEZ蛋白。生物信息学结果表明,大多数是细胞质蛋白,这些蛋白可能具有破坏宿主血脑屏障的潜在功能。其中一些蛋白在其他细菌中为已知的毒力因子,包括烯醇化酶。进一步试验证明,烯醇化酶为SEZ分泌蛋白,并且可以粘附于mBMEC。烯醇化酶可作为保护性抗原有效保护小鼠免于感染SEZ,并且其抗体显著降低了 SEZ培养上清对mBMECs的细胞毒性。