论文部分内容阅读
马兜铃酸肾病(Aristolochic Acid Nephropathy, AAN)指长期或过量使用含有马兜铃酸(Aristolochic Acid, AA)成分的中草药导致的肾小管间质病变。马兜铃酸Ⅰ(aristolochc acid I,AA I)是AA中含量最高、毒性最强的成分,可引起上皮细胞转分化为肌成纤维细胞、肾小管上皮细胞坏死或凋亡,触发肾间质纤维化。在纤维化过程中,上皮、内皮细胞间质转分化(EMT/EnMT)为肌成纤维细胞,被认为是在肾脏纤维化疾病的发病机制中发挥作用的重要因素之一。EMT的信号由各种生长因子／细胞因子集调节,其中转化生长因子-β(transforming growth factor-β)被认为是EMT产生肌成纤维细胞最有力的生长因素之一。通常认为与其相关的受体、Smads蛋白、辅助因子、转录调节的靶基因共同组成了一个TGF-p信号传导通路。Smads蛋白有三种亚型：受体激活Smads蛋白(R-Smad);共同介质型Smads蛋白(Co-Smad4);抑制型Smads蛋白(I-Smad6、7).其中I-Smads在蛋白降解方面以及对TGF-β信号的调节过程中发挥着重要的作用。乙酰化的Smad7可定向结合去乙酰化组蛋白酶1(histone deacetylases1, HDAC1)使其去乙酰化而进行泛素化作用促进蛋白的降解,当HDAC1过度表达并被转录因子募集时,就会导致与其相关的特定基因被非正常性抑制,从而导致疾病的产生。因此,阐明Smad7的去乙酰化作用在TGF-β/Smad7信号通路中对AAN的调控,了解分析HDAC1在AAN发病过程中的基因和蛋白表达以及蛋白定位,对于进一步揭示马兜铃酸肾病具有重要的意义。为此,本研究复制了小鼠AAN模型和小鼠原代RTECs细胞AAN模型,观察了AAⅠ所致小鼠AAN的病理学特征,研究了AAⅠ作用下小鼠RTECs肾纤维化中相关因子及TGF-β1/Smads信号通路分子相关基因及蛋白表达水平变化,分析了引起细胞纤维化的分子机制,探讨了在AAⅠ作用下小鼠肾间质纤维化的发病机理。其主要研究内容如下：AAⅠ对AAN和TGF-β1/Smads信号通路中相关因子的基因和蛋白表达的影响通过复制小鼠马兜铃酸肾纤维化(AAN)模型,检测肾组织中转化生长因子-p1(TGF-β1)、Smad7和去乙酰化蛋白酶1(HDAC1)的mRNA和蛋白,分析AAN模型TGF-β1信号通路中HADC1和Smad7蛋白的分布与表达变化。免疫组织化学检测CK-18、α-SMA的蛋白表达,定位HADC1和Smad7蛋白；HE染色观察肾脏的病理学变化；RT-PCR检测TGF-β1、Smad7和HDAC1的mRNA表达；ELASA检测TGF-β1的蛋白表达；Western Blot和免疫共沉淀检测HADC1和Smad7蛋白表达及相互作用。结果表明,免疫组化结果显示染毒组小鼠CK-18表达阴性,CK-18表达依次减弱趋势；SMA表达阳性,并随给药剂量逐渐增强。肾脏病理表现为肾小管浊肿、变性和肿(?)等急性小管间质损伤并随着染毒时间的延长而呈现逐渐加重的趋势。AAN模型肾组织中TGF-β1和HDAC1mRNA表达呈时间依赖性升高,TGF-β1mRNA表达较对照组具有显著性差异(P<0.05),TGF-β1蛋白从28d开始显著升高,且与对照组比较差异极显著(P<0.01)；Smad7mRNA和蛋白表达均呈下降趋势,且自35d开始校对照组有显著性的下降(P<0.05)；HDAC1mRNA和蛋白表达量随着时间的延长.增多,28d开始AAN组中HDAC1mRNA水平极显著高于对照组(P＜0.01)；HDAC1蛋白免疫组化染色强度呈上调趋势,且HDAC1阳性着色主要分布于上皮细胞和间质细胞的细胞核；免疫共沉淀试验结果证实,在AAN中HDAC1与Smad7形成蛋白复合物。结论为成功复制了小鼠AAN模型,证实AAⅠ对小鼠肾脏具有明显的损害作用,表现为早期肾间质纤维化,证实了肾小管上皮细胞是AAⅠ作用的主要靶细胞。AAⅠ对AAN的发展具有时间和剂量依赖型作用,TGF-β1/Smad7信号参与了AAⅠ诱导的EMT,Smad7是AAⅠ作用的靶点之一。HDAC1蛋白高表达并与Smad7蛋白形成蛋白复合物,参与了TGF-β/Smad信号通路介导的AAN形成过程。AAⅠ对小鼠原代RTECs中TGF-β1/Smads信号通路中相关因子的影响通过构建小鼠原代RTECs的AAN模型,探讨AAⅠ对RTECs的作用及TGF-β1/Smads信号中相关因子的变化,阐明AAN的发病机制。培养小鼠原代RTECs细胞,通过细胞形态学观察和免疫荧光染色鉴定细胞；RealTime-PCR检测TGF-β1、 TβR-I、Smad7和HDAC1的mRNA表达；ELISA分析细胞上清中TGF-β1的蛋白表达。结果表明,胶原酶消化法成功培养小鼠原代RTECs。高浓度的AAⅠ短时间内造成直接的肾小管上皮细胞毒性,导致细胞脱落和坏死；小剂量的AAⅠ长时间作用可诱导上皮细胞转分化；100ng/ml的AAⅠ随作用于细胞时间的延长,细胞形态变为纤维细胞样。免疫荧光染色结果显示,AAⅠ作用细胞后,CK-18表达下调。AAⅠ可促进TGF-β1、TPR-I和HDAC1的mRNA表达,刺激细胞分泌TGF-β1, Smad7mRNA和蛋白表达均显著下降。结论为成功培养了小鼠原代RTECs细胞,AAⅠ诱导RTECs细胞转分化,构建小鼠原代RTECs细胞AAN模型,从体外试验证实了肾小管上皮细胞是AAⅠ作用的主要靶细胞,HDAC1是AAⅠ作用的靶点之一。AAⅠ可诱导小鼠原代RTECs细胞合成和分泌TGF-β1,抑制Smad7的表达,证实了TGF-β1/Smads信号通路参与了AAⅠ诱导的间质纤维化。siRNA对小鼠原代RTECs中HDAC1基因的作用通过建立有效的脂质体转染法,转染小干扰RNA(siRNA),抑制小鼠肾小管上皮细胞(Renal Tubular Epithelial Cells, RTECs)中去乙酰化组蛋白酶1(Histone deacetylases1,HDAC1)的表达,检测对TGF-β1/Smads信号通路中其他因子的蛋白表达,进一步了解AAN发展的分子机制。利用阳离子脂质体法瞬时转染,荧光标记siRNA (FAM-siRNA)筛选转染比例,实时荧光定量PCR(Real Time-PCR)确定最优条件并检测不同位点(374,525和822)HDAC1-siRNA的抑制效果,噻唑蓝(MTT)法检测不同时间点HDAC1-siRNA对RTECs增殖的影响,与曲古霉素A (TSA)对RTECs的作用效果相比较。Real-time PCR检测对HDAC1mRNA表达的抑制作用,DNA阶梯检测细胞凋亡。Western Blot检测TβR-I、Smad7和HADC1的蛋白质表达。结果表明,荧光表达和Real-Time PCR结果显示30pmol siRNA:1.5μL LipofectamineTM2000为最佳转染条件。Real-Time PCR结果表明HDAC1-374的干扰效果最明显。HDAC1-374MTT检测结果与TSA的MTT结果一致,均能有效抑制RTECs的增殖。HDAC1-siRNA和TSA在体外均能抑制细胞的生长增殖并诱导细胞凋亡。HDAC1-siRNA转染能有效地抑制细胞中HDAC1基因mRNA及蛋白的表达,Smad7蛋白表达增加,对TβR-Ⅰ的蛋白表达影响不大。结论为本试验利用脂质体法成功转染HDAC1-siRNA,抑制RTECs增殖,诱导RTECs凋亡,同TSA作用相似。HDAC1-siRNA抑制HDAC1的表达,解除AAN中Smad7的过度去乙酰化,增加Smad7蛋白表达,对于抗纤维化有重要意义。HDAC1可作为AAN基因治疗的新靶点,HDACi可用于防治AAN的发生。