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研究背景与目的:随着环境污染的恶化、生活习惯的改变、视频终端的普及,眼部用药的增加,干眼发病率日益增高,全球已有15~35%的人口出现了干眼相关的症状或体征。干眼所引起的眼部不适、视觉障碍、泪膜不稳定和眼表损害,以及伴有的泪液渗透性升高和眼表炎症增加严重影响了人们的视觉和生活质量。干眼的发病机制尚不明确,但炎症和氧化应激损伤在干眼发病中的重要作用已逐步得到国际上公认。目前对于干眼的治疗,主要是使用人工泪液及凝胶等泪液替代物以及糖皮质激素和环孢霉素A等抗炎药物,但各种药物均有其治疗的局限性或显著的副作用,国际上也缺乏治疗不同类型干眼的有效方法。因此从干眼的发病机制出发,探寻有效治疗干眼的药物,是临床亟待解决的关键问题。抗艾滋药物叠氮胸腺(AZT),是一种抗病毒药物,属核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs),通过竞争性抑制艾滋病病毒逆转录酶,终止了病毒DNA链的延长,因此产生治疗作用。2014年NRTIs在老年黄斑变性(AMD)中的抗炎作用首次被报道,研究表明NRTIs可以通过抑制炎症小体激活对AMD动物模型起到保护作用,这一作用机制独立于其逆转录酶抑制剂的作用机理,抑制caspase-1激活的作用是特异性的。在眼表疾病中,目前也有研究表明,干眼症及糖尿病相关眼表病变也与NLRP3炎症小体的激活有关,但关于NRTIs类药物在眼表疾病中是否具有抗炎治疗作用尚未见报道。本实验通过建立人角膜上皮细胞的氧化应激模型,观察氧化应激与炎症反应的关系及其作用通路,探讨AZT在氧化应激模型中是否可以通过调节细胞氧化系统与抗氧化系统的平衡,起到抗氧化应激及抗炎作用,并进一步探讨AZT可能的作用靶点,为干眼治疗的研究提供新的思路和可选择的方法。研究方法:1.培养人角膜上皮细胞,建立氧化应激体外模型。(1)4-HNE诱导氧化应激模型:10μM,20μM,30μM 4-HNE(2)高渗细胞应激模型:70mM,90mM Nacl2.对两种细胞模型分别进行以下测定,观察细胞氧化应激水平及炎症因子表达。用LDH细胞凋亡试剂盒测定细胞凋亡水平;DCFDA试剂盒测定细胞内总ROS反应水;NFκB试剂盒测定细胞裂解液中NFκB p65水平;细胞因子蛋白质组分析试剂盒筛选细胞因子;western blot检测NLRP3炎症小体激活标志物caspase1p10/p20以及ROS相关酶的测定等。3.观察叠氮胸腺对不同氧化应激模型的抗炎及抗氧化应激作用分别用50μM,100μM AZT预处理HCE细胞1.5小时,用4-HNE或Nacl刺激HCE细胞后,用以下方法进行检测:(1)LDH法检测AZT预治疗后不同HCE细胞应激模型的细胞毒性,测定细胞凋亡水平(2)应用DCFDA细胞活性氧检测检测试剂盒,可以持续性观察叠氮胸腺预治疗后不同HCE细胞应激模型的ROS水平(3)酶联免疫吸附试验测定细胞培养基中促炎细胞因子的浓度,如IL-6,IL-8等;观察叠氮胸腺治疗对炎症因子表达是否起到抑制作用(4)用NFkB p65转录因子检测试剂盒检测细胞内NFκB p65水平,采用R&D System的Proteome Profiler Human NFk B Pathway Array Kit(NF-κB蛋白质组分析试剂盒)进行NFκB通路蛋白筛选分析(5)Western Blot方法从蛋白水平检测ROS相关酶的表达。研究结果:1.AZT预治疗后不同HCE细胞应激模型的细胞活性增强100μM的AZT治疗后,20μMHNE组细胞死亡率减少了7.729%,70mM NaCl组细胞死亡率从非治疗组的8.47±0.70%亦降低至3.60±0.44%,接近对照组水平(4.147±.8772%)。2.AZT预治疗后不同HCE细胞氧化应激中ROS反应水平降低对照组细胞在150分钟时表达的ROS水平为14760±572RFU,用20μM处理后ROS产生增加至18189.5±525.5RFU(P<0.05),而100μM AZT治疗组,ROS水平降低至14332±3611.5RFU,接近对照组水平(P<0.05)。同样,在70mM NaCl诱导的细胞应激模型中,ROS在150分钟处理后ROS水平为6590.33±821.62 RFU,较对照组4170.50±129.04RFU显著提高(P<0.01);100μM AZT治疗组,ROS水平降至5016.67±327.06RFU(P<0.05)。3.AZT预治疗后不同HCE细胞氧化应激模型中NFκB p65蛋白水平下调20μM 4-HNE或70mM NaCl处理HCE细胞24小时后,相对于对照组NFκB p65,其NFκB p65表达分别增加为138.952±6.633%和126.83%±3.79%,在100μM AZT预治疗后,NFκB p65活化的显著降低,相对对照组而言,20μM 4-HNE组下降至81.9±2.637%(P<0.01),70mM NaCl组下降至87.99±1.53%(P<0.05)。4.AZT在NFκB通路蛋白中可能的靶点分析本实验采用R&D System的Proteome Profiler Human NFk B Pathway Array Kit(NFkb蛋白质组分析试剂盒)进行NFκB通路蛋白筛选分析,用100μM AZT预处理后,用20μM 4-HNE处理,检测到NFκB信号通路的41个蛋白质和4个丝氨酸或酪氨酸磷酸化位点,4-HNE处理组CD40/TNFRSF5,KKγ/NEMO,p53,c-Rel,TRAF2,TRAIL R1/DR4,SOCS6,STAT1(pY701)表达水平较对照组有所增强,AZT100μM组信号减弱,其中TRAIL R1/DR4,SOCS6,IκBα降至对照组水平。5.Western Blot测定AZT治疗后抗氧化酶水平变化Western Blot测定细胞内SOD1及NQO1蛋白水平显示,用20μM 4-HNE处理的HCEC中的SOD1表达降低,条带密度为对照组62.06%,50μM和100μM AZT治疗组相对于对照组密度将相对条带密度分别增加至95.79%和78.43%(P<0.05)。NQO1用20μM 4-HNE处理24h后,条带密度相对于对照组增加至146.3%,50uM和100uM AZT治疗组条带密度相对于对照组表其达水平分别降至136.6%和113.11%(P<0.05)。同样,在70mM Nacl诱导的细胞模型中,70mM Nacl组SOD1蛋白水平相对于对照组仅为39.10%,在细胞在用50μM或100μMAZT预治疗后,SOD1表达水平相对于对照组分别上升为为49.5%和65.1%(p<0.05)。6.AZT预治疗后不同HCE细胞应激模型中IL-6表达降低ELISA结果显示,20μM HNE诱导HCE细胞后,与对照组34.227±4.702 pg/mL相比,IL-6的表达增加至66.247±3.433pg/mL pg/mL,当使用100μM AZT治疗后,IL-6降低至11.536±1.866 pg/mL(P<0.01)。同样,用70mM NaCl处理HCEC24小时后,相对于对照组7.406±1.153 pg/mL,IL-6表达水平上升至48.43±1.153(P<0.01),用100μM AZT预处理的细胞IL-6表达水平降至6.37±1.547pg/mL(P<0.01)。研究结论:1.本研究通过使用不同浓度的AZT分别治疗4-HNE及高渗诱导人角膜上皮细胞氧化应激模型,证实了AZT可以通过调整细胞内氧化系统和抗氧化系统的平衡,降低细胞内总的ROS反应水平,抑制NF-κB反应通路,降低IL-6炎性细胞因子的表达,改善细胞存活。2.本实验研究发现,AZT并未通过抑制NLRP3炎症小体的激活发挥作用,但尚需进一步研究证实。3.通过NF-κB反应通路相关蛋白的筛选,本实验发现AZT在抗氧化应激过程中可能的作用机制,即通过CD40—TRAF2—NF KappaB—IL-6通路对人角膜上皮细胞起到保护作用。但这一结论需要通过进一步对相关蛋白进行DNA,RNA及蛋白水平的测定进行证实。