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人乳头瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）的持续感染是引起宫颈癌和生殖器疣的最主要原因，开发、研制HPV预防性疫苗是预防HPV感染的最根本手段。判断预防性疫苗成功与否的关键是其能否诱导有效的体液免疫反应，因此建立稳定的、有效的中和抗体检测方法是评价HPV疫苗免疫原性的重要手段。本课题的主要研究目的就是建立以假病毒为基础的体外HPV中和抗体检测方法并对其进行初步应用。将密码子优化的L1、L2基因表达质粒和含GFP基因的报告质粒共转染293FT细胞，共制备了六种型别假病毒（HPV16，HPV18，HPV58，HPV45，HPV6和HPV11），假病毒滴度用TCID50表示，分别为107.38／100μl，106.57／100μl，106.59／100μl，107／100μl，106.33／100μl，104.8／100μl。选择200～300TCID50／50μl的假病毒接种量，建立了以HPV16，HPV18，HPV58，HPV45，HPV6和HPV11六种型别假病毒为基础的HPV中和抗体检测方法。用该方法对不同HPV58L1 DNA疫苗（L1h、L1hΔc、L1S、L1SM和L1wt）所诱导的中和抗体进行检测。各疫苗均以pcDNA3．1为载体，L1h含有密码子优化的L1基因；L1hΔc含羧基端截短的密码子优化的L1基因；L1S为pcDNA3．1中克隆入p58LLw中的L1基因；L1SM为突变型L1S，在构建L1S时，L1基因第485位碱基G突变为A；L1wt含有野生型HPV58 L1基因。结果显示L1S和L1h可诱导小鼠产生中和抗体，L1S诱导的中和抗体的平均滴度为6400，明显高于L1h诱导的中和抗体水平（平均滴度为48），但其他三种DNA疫苗（L1hΔc、L1SM和L1wt）不能诱导小鼠产生中和抗体，说明含不同基因片段的DNA疫苗诱导中和抗体的能力不同。用该方法对不同人群血清中HPV型特异性中和抗体进行了检测，结果显示在82份宫颈癌患者血清样本中，中和抗体阳性率为28．0％，中和滴度在160～640之间，其中HPV16中和抗体阳性样本超过80％。在50份其他妇科疾病患者血清样本中，只检出一份HPV6中和抗体阳性样本，中和滴度为2560，中和抗体阳性率仅为2％，与宫颈癌患者中和抗体阳性率的差异具有统计学意义（X2）=16．1，P<0．05)。在生殖器疣患者血清样本中，HPV型特异性中和抗体阳性率为36．0％，阳性样本中和抗体滴度在160～2560之间，中和抗体阳性样本中，HPV6中和抗体阳性样本占66．7％。利用凯普核酸扩增分型试剂盒进行HPV核酸检测及型别分析，结合血清HPV16、HPV18、HPV58、HPV45、HPV6和HPV11中和抗体检测结果，分析中和抗体和HPV DNA的关系。在182份样本中，共有114（62．6％）份样本HPVDNA阳性，42（23．1％）份样本中和抗体阳性，DNA和中和抗体检测结果的一致性为49．5％，二者检出率之间的差异具有统计学意义（X2=56．3，P<0．05）。其中，中和抗体和HPV DNA均为阳性的样本占17．6％，中和抗体阳性而HPV DNA阴性的样本占5．5％，中和抗体阴性而HPV DNA阳性的样本占45．1％，中和抗体和HPV DNA均为阴性的样本占31．9％。在中和抗体阳性样本中，DNA阳性样本和DNA阴性样本所对应的中和抗体滴度的几何均值分别为281．0和422．2。HPV16 DNA与HPV16型特异性中和抗体之间的检出率的一致性为65．9％，二者之间的差异具有统计学意义（X2=31．2，P<0．05）。建立HPV假病毒小鼠感染模型，为HPV感染干预研究、疫苗评价及预防药物的筛选奠定基础。将密码子优化的HPV衣壳蛋白基因表达质粒和荧光素酶报告基因表达质粒共转染293FT细胞，48小时后收集裂解细胞，收获假病毒，并对假病毒滴度进行测定，HPV16、HPV45、HPV58和HPV6滴度分别为3．7×108TU／ml，1．5×108TU／ml，1．2×108TU／ml和3.3×107TU／ml。试验小鼠皮下注射甲羟孕酮醋酸酯，4天后阴道灌注壬苯醇醚-9，并在6小时后阴道灌注假病毒，7天后阴道灌注荧光素酶底物，并检测荧光素酶报告基因的表达情况。HPV16、HPV45、HPV58和HPV6小鼠模型15μl假病毒感染量的荧光信号强度分别为1．779e+06p／s，1．829e+06 p／s，5．738e+05 p／s和5．718e+05 p／s，5μl假病毒感染量荧光信号强度分别为3．715e+05 p／s，3．715e+05p／s，3．942e+05 p／s和0 p／s。我们利用退火时间逐渐延长的两步PCR法，以棉拭子中提取并分型的DNA为模板成功扩增出片段大小约8kb的9种型别的HPV全基因序列，包括HPV16，HPV58，HPV11，HPV33，HPV59，HPV52，HPV53，HPV42和HPV68，各全基因序列均被成功克隆入pEASY-T3克隆载体中，测序及同源性分析结果显示，本试验中扩增得到的HPV16，HPV58，HPV11，HPV33，HPV59，HPV52，HPV53，HPV42全序及L1序列均与GENEBANK中已知序列具有99％左右的同源性，为已知型别的变异体，得到的HPV68全序与HPV68a的同源性为93％，而与ME180-HPV（HPV-68b）的同源性为99％，其L1读码框序列与HPV68a和ME180-HPV L1读码框核苷酸序列的同源性分别为92．6％和99．5％，据此判断该全序为HPV-68b。