论文部分内容阅读
草鱼出血病致病机理的研究对培育草鱼抗病新品种至关重要,因此本实验室利用二代测序技术获得了草鱼出血病进程中不同组织、不同时间点的28个样本的表达谱。本研究以此为基础,对28个表达谱的数据进行了进一步挖掘,并对从中找到的丙型肝炎病毒入侵途径中的丙型肝炎受体分子CD81进行了克隆和初步的功能研究。主要结果如下:
对表达谱中的差异表达基因进行层级聚类,发现GCRV入侵机体的病程按时间可分为三个部分:第一天,第二、三天,第四到六天。对显著差异表达的基因进行了KEGGpathway的富集分析,发现了唯一的病毒侵染途径—丙型肝炎病毒入侵途径,且该途径中的受体分子SR-B1,LDLR,CD81,CLDN和OCLD在GCRV入侵草鱼的过程中都呈现显著的表达变化。
克隆了草鱼CD81基因的cDNA,其中5非翻译区(UTR)87bp,3非翻译区(UTR)581bp,开放阅读框(ORF)为708bp,共1376bp,编码235个氨基酸。与本实验室已经得到的草鱼基因组比对,发现草鱼CD81基因组包含8个外显子,7个内含子。蛋白结构预测结果显示CD81基因所编码蛋白具有明显的TM4SF家族特征,含有四跨膜蛋白结构域,无明显信号肽,跨膜区保守,但在胞外区变异性较高。绿色荧光蛋白(GFP)示踪显示草鱼CD81定位于细胞膜上。
草鱼CD81基因在腮、脑、肝、脾、中肾、头肾、肠组织中均有表达,头肾中表达量最高。GCRV攻毒后草鱼鳃、脾、肝、肠及头肾5个组织中的CD81基因表达量均有明显上调表达。
对CD81基因编码框进行c-SNP搜索,发现了5个SNP位点,造成了4个氨基酸的改变,这5个SNP位点连锁在一起,形成两种等位基因,基因型频率与草鱼GCRV抗性显著相关。
此外,本研究还制备了草鱼CD81基因的多克隆抗体,用于后续的实验分析。
本研究从草鱼GCRV进程的表达谱中有显著变化的基因中锁定CD81作为研究目标,克隆了草鱼CD81基因,并进行了初步的功能研究,为草鱼GCRV致病机制的研究提供了一定的线索。