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研究背景及目的：黑色素瘤抗原基因(Melanoma antigen-encoding gene，MAGE)家族是最早被报道的人类肿瘤-睾丸(Cancer-testis，CT)抗原基因。MAGE基因首先发现于1991年，后来发现MAGE基因实际是一个大家族，包括MAGE-A，MAGE-B和MAGE-C三个亚家族。MAGE-3基因属于MAGE-A亚家族。在MAGE基因家族中，MAGE-3基因在多种肿瘤中表达率是最高的，其编码的蛋白质长为314个氨基酸残基(分子量为34747Da)，此基因定位于Xq28。MAGE-3肿瘤抗原分子内现已确定12个MHC-Ⅰ类分子限制性表位和8个MHC-Ⅱ类分子限制性表位。MAGE-3抗原目前在肿瘤治疗性疫苗的研究方面应用广泛，以MAGE-3为基础的肿瘤疫苗主要包括：某个MAGE-3抗原肽、MAGE-3基因全蛋白、能够编码MAGE-3基因全蛋白或某个抗原肽的重组病毒及由某个抗原肽或全蛋白冲击的树突状细胞等，均已进行了相应的体外及临床体内试验并取得一定效果。其中报道比较多的是以肽段为基础的疫苗，但因这些肽段的MHC限制性，使用范围较局限。将全蛋白做为免疫原使用就可能避开这种限制性而诱导产生更明显更全面的T细胞免疫应答。本实验意在通过诱导重组质粒pET30a(+)-MAGE-3在大肠杆菌中表达MAGE-3蛋白，为进一步研究MAGE-3全蛋白肿瘤疫苗及以MAGE-3为基础的相关研究提供基础。 方法：从小细胞肺癌癌组织中提取总RNA，通过RT-PCR扩增出MAGE-3全长编码序列：将其连接在pGEM-T Easy质粒上，转化JM109，利用Amp抗性和蓝白筛选筛选转化细菌的阳性菌落，运用pGEM-T Easy载体克隆鉴定引物T7／SP6对连接的正确性进行鉴定，从而确定阳性克隆，且进行DNA测序，以确保克隆的靶基因的正确性；将重组质粒pGEM-T Easy-MAGE-3和原核表达质粒郑州人学硕卜学位论文MAGE一3原核表达载体的构建和表达pET30a(+)同时用灿01酶切，电泳胶回收纯化后对线性载体pET30a(+)进行去磷酸化处理，将线性载体与目的基因连接，转化BLZI(DE3)，筛选出阳性菌落，通过引物T7彻PZ鉴定出阳性克隆(正插重组子)，并进行DNA测序;转化菌经IPTG诱导表达，并经12%SDS一队GE凝胶电泳，考马斯亮蓝染色及M触stem blot鉴定表达情况。结果:1.靶基因扩增及酶切鉴定:通过Rl’- PCR扩增得到约0.95kb MAGE一3全长编码序列，并分别经Hindm和EcoRI酶切鉴定，结果与预期相符。2.克隆和亚克隆重组子结果鉴定: 靶基因与pGEM一T Easy质粒连接后，转化JM 109，蓝白筛选后随机选择6个阳性菌落以T7/s P6作为引物进行PCR扩增，均得到长于约为1 .1 kb的扩增片段，均为阳性克隆。 将去磷酸化的pET30a(+)双粘质粒与双粘靶片段MAGE一3连接，转化BL21(DE3)，对9个阳性克隆进行以T7佩PZ为引物的PCR扩增，有三个菌落的扩增产物大小约为l.Zkb，为阳性克隆(正插重组子)。 对阳性克隆进行DNA测序证实，我们所克隆/亚克隆出的MAGE一3基因片段的碱基组成与GenBank公布的MAGE一3 NM 005362基因序列完全一致。3.pET3oa(+)一MAGE一3在BLZI(DE3)中表达:转化菌经IPTG诱导表达，并经12%SDS一PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝染色及W七stem blot鉴定，证明了MAGE一3蛋白的成功表达。结论:本实验利用分子生物学方法，成功构建了原核表达载体PET30a(+)一MAGE一3，并诱导其在宿主菌内的成功表达。通过此项研究，得到了MAGE一3全蛋白抗原，为以MAGE一3全蛋白为基础的肿瘤治疗疫苗的研究及一些辅助研究打下良好的基础。