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第一部分HDAC6介导了MPP~+诱导的α-synuclein聚集体的aggresome-大自噬降解途径目的:利用MPP~+处理过表达人类突变型(A53T)α-synuclein的PC12细胞株(α-SNA53T~+PC12)和SH-SY5Y细胞株,构建帕金森病细胞模型,探讨HDAC6对MPP~+诱导的α-synuclein聚集体的aggresome-大自噬降解途径的调控。方法:用1.5mM的MPP~+处理α-SNA53T~+PC12和SH-SY5Y细胞,通过免疫印迹法观察细胞内HDAC6蛋白水平的变化,并利用免疫荧光共聚焦技术观察HDAC6与γ-tubulin和LAMP-1的共定位情况;分别用自噬抑制剂3-MA、siRNA干扰HDAC6及HDAC6特异性抑制剂Tubacin和/或MPP~+共处理α-SNA53T~+PC12细胞后,利用免疫印迹法和免疫荧光共聚焦技术观察HDAC6、α-synuclein和LC3蛋白水平及其在细胞内定位的改变;并进一步通过提取细胞核蛋白观察HDAC6对α-synuclein亚细胞定位的影响。结果:(1)MPP~+诱导细胞内HDAC6表达明显增加并且定位发生改变,其与γ-tubulin、LAMP-1和α-synuclein共定位于细胞核周围形成aggresome样小体。(2)MPP~+诱导α-synuclein聚集体与LC3共定位于细胞核周围及细胞突起,抑制自噬导致α-synuclein增多。(3)敲减或抑制HDAC6导致MPP~+诱导的α-synuclein聚集体进一步在细胞内蓄积,且不能在核周形成aggresome样小体,并大量聚集于细胞核内。(4)进一步观察发现敲减或抑制HDAC6阻止了MPP~+诱导下LC3-Ⅱ蛋白表达的上调以及LC3荧光信号的增强。结论:HDAC6通过调控aggresome-大自噬途径参与了MPP~+诱导的异常聚集的α-synuclein的降解,缺乏HDAC6阻碍了MPP~+诱导的α-synuclein聚集体形成aggresome及自噬活性的反应性上调,导致大量α-synuclein蓄积于细胞核内。第二部分HDAC6调控了分子伴侣介导的自噬途径对MPP~+诱导的α-synuclein聚集体的降解目的:利用MPP~+处理过表达人类野生型(WT)和突变型(A30P)α-synuclein的PC12细胞株(α-SNWT~+PC12和α-SNA30P~+PC12),构建帕金森病细胞模型,探讨HDAC6对MPP~+诱导的α-synuclein聚集体的分子伴侣介导的自噬降解途径(CMA)的调控。方法:利用siRNA技术干扰α-SNWT~+PC12和α-SNA30P~+PC12细胞的HDAC6,并通过免疫印迹法鉴定干扰效率;用siRNA干扰和/或MPP~+共处理α-SNWT~+PC12和α-SNA30P~+PC12细胞后,利用免疫印迹法观察α-synuclein、LAMP-2a和HSC70蛋白水平的变化;并通过免疫荧光共聚焦技术观察α-SNWT~+PC12细胞内LAMP-2a和LAMP-1的共定位;同时,采用ELISA方法观察α-SNWT~+PC12细胞内RNase A的变化;并进一步通过免疫共沉淀方法观察HDAC6对α-SNWT~+PC12细胞内HSP90乙酰化及其与LAMP-2a和HSC70相互作用的影响。结果:(1)RNA干扰48小时,两株细胞中的HDAC6表达均明显降低,大约在60%左右;(2)MPP~+处理后突变型α-synuclein蛋白水平增加,野生型α-synuclein增加不明显,而缺乏HDAC6导致两株细胞中的α-synuclein均明显增加;(3)MPP~+诱导两株细胞LAMP-2a和HSC70表达增加,缺乏HDAC6致使野生型细胞内LAMP-2a进一步增加,而突变型LAMP-2a表达轻度下降,HSC70表达代偿性增加;(4)MPP~+减少了α-SNWT~+PC12细胞内的RNase A,缺乏HDAC6导致细胞内RNAse A明显增多;(5)MPP~+诱导α-SNWT~+PC12细胞的LAMP-2a荧光信号增强,缺乏HDAC6致使LAMP-2a荧光信号进一步增加,且LAMP-1荧光信号也相应增强;(6)MPP~+诱导α-SNWT~+PC12细胞内HSP90乙酰化水平下降,其与HSC70和LAMP-2a的相互作用增加,而缺乏HDAC6导致HSP90乙酰化水平增加,其与HSC70和LAMP-2a的结合下降。结论:MPP~+诱导了CMA活性的上调,且上调的CMA可代偿性降解MPP~+诱导的野生型α-synuclein;HDAC6参与了MPP~+诱导的CMA活性的反应性上调,并通过调节HSP90的乙酰化影响野生型α-synuclein的CMA降解途径。第三部分HDAC6对MPP~+诱导的α-synuclein聚集体所致的细胞损伤的拮抗作用目的:利用MPP~+处理PC12细胞株(PC12、α-SNWT~+PC12、α-SNA30P~+PC12和α-SNA53T~+PC12)和SH-SY5Y细胞株,构建帕金森病细胞模型,探讨HDAC6对MPP~+诱导的α-synuclein聚集体所致的细胞损伤的拮抗作用。方法:以siRNA干扰或Tubacin抑制HDAC6,并与MPP~+相结合的方法共处理各株细胞达12小时,然后通过MTT法检测细胞活力,LDH法评定细胞损伤,并通过流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,光镜观察活细胞一般形态学变化,同时采用透射电镜方法观察细胞超微结构的改变。结果:(1)MPP~+处理12小时后各株细胞活力均降低,敲减HDAC6导致过表达WT、A30P、A53Tα-synuclein PC12细胞活力进一步降低;(2)暴露于MPP~+处理12小时致使各株细胞LDH释放量均增加,敲减HDAC6导致过表达WT、A30P、A53Tα-synuclein PC12细胞损伤进一步增加;(3)MPP~+作用12小时后细胞的早期凋亡显著增高,抑制HDAC6导致过表达WT、A30P、A53Tα-synuclein PC12细胞的早期凋亡进一步增加;(4)活细胞形态学观察MPP~+诱导细胞形态改变,缺乏HDAC6导致过表达WT、A30P、A53Tα-synuclein PC12细胞明显积聚,尤其是过表达A53T的PC12细胞;(5)细胞超微结构显示MPP~+处理后细胞内自噬结构增多,抑制HDAC6细胞内自噬囊泡减少,在过表达WT或A53Tα-synuclein PC12细胞内可见各种细胞凋亡改变。结论:HDAC6是一种细胞内主要的应对MPP~+毒性应激反应的调节因子,其极可能通过对易聚集α-synuclein清除过程的调控来抵抗MPP~+毒性,从而在一定程度上发挥保护功能。