锌指是一种能与DNA结合的结构域，为锌指蛋白中的半胱氨酸和/或组氨酸与二价的锌离子结合形成的一种特定的二级结构。锌指蛋白可以通过与双链DNA、单链DNA及RNA的结合发挥转录调节及RNA剪接等功能。根据与锌离子结合的氨基酸的不同，锌指蛋白可以分为许多亚家族，其中C<,2>H<,2>(或Kruppel)型锌指蛋白是其最大的亚家族，它的锌指序列的特征为CX<,2>CX<,3>FX<,5>LX<,3>X<,3>H：两个锌指之间的保守序列为TGEKP(Y/F)X(X代表在保守氨基酸之间的任意氨基酸)。而C<,2>H<,2>型锌指蛋白又可以根据其N端含有的结构域分成4大类：FAX型， FAR型，POZ和KRAB型。 含KRAB结构域的锌指蛋白也称KRAB型锌指蛋白(KZNF)，占人类基因组中所有锌指蛋白(799种)的约三分之一(290种)，是哺乳动物中最大的转录调控因子家族，其中超过220种在胚胎发育、细胞分化、细胞转化及细胞周期的调控中发挥重要功能，其表达水平随时间和空间的不同而变化。 Mipul是本室从经历短暂缺血一再灌注的大鼠心肌中分离克隆的新基因，Genbank登录号为AY221750。其ORF的全长为1827bp，编码608个氨基酸。其编码肽链的N-端含一KRAB结构域，C-端含14个C<,2>H<,2>型锌指，故为一典型的KRAB/C<,2>H<,2>型锌指蛋白。本室近年研究发现，Mipul基因在缺血-再灌注心肌中表达明显升高；Mipul过表达可减轻去血清对C<,2>C<,12>细胞的生长抑制作用，在去血清应激状态下具有促细胞生长及修复损伤的功能；Mipul过表达可明显抑制氧化应激(H<,2>O<,2>处理)导致的LDH释放率和细胞凋亡发生率，具有细胞保护功能。本文拟进一步阐明Mipul的功能及结构一功能关系。 为了探讨新基因Mipul的DNA结合活性，首先构建了Mipul的多个原核和真核表达质粒。利用原核表达质粒pGEX-Mipul，诱导表达并纯化了Mipul的融合蛋白GST-Mipul。将GST-Mipul固定在 Glutathione-Sepharose上后，从随机寡核苷酸文库中筛选到了一个Mipul共同的DNA结合序列5-TGTCTTATCGAA-3。经化学合成包含这一序列的探针，末端同位素标记后进行EMSA发现，GST-Mipul能与探针结合，并呈剂量依赖性，但纯化的GST蛋白不能与探针结合；GST-Mipul与探针的结合信号能被非标记探针(冷探针)竞争，但不能被含突变核心序列(CTTA)的冷探针竞争。在EMSA的结合缓冲液中加入EDTA，则融合蛋白与探针的结合作用被废除。这些结果说明，5’-TGTCTTATCGAA-3’是Mipul的特异性DNA结合位点(MDBS)，其结合作用具有锌离子依赖性，其中CTTA为结合位点的核心序列。为了进一步揭示Mipul与DNA的结合作用，表达与纯化了不包含KRAB结构域及KRAB与锌指之间的连接序列，仅包含14个锌指的融合蛋白GST-ZF。化学合成包含Mipul的特异性结合位点的探针，并用生物素进行末端标记。Target detection asSSay显示，探针能与融合蛋白GST-Mipul和GST-ZF结合，但不能与GST结合，并且上述结合作用具有锌离子依赖性。 为探讨Mipul中锌指结构域的功能，将Mipul的14个锌指分成二大段，表达与纯化了只包含部分锌指的融合蛋白，即GST-ZF1(包含1-8个锌指)和GST—ZF2(包含9一14个锌指)。Target detection asssay显示，只有其中的GST-ZF2能与探针结合。 为了进一步探讨Mipul是否具有转录因子功能，将含三个MDBS的寡核苷酸序列插入报告基因载体pGL3-promoter构建了重组报告基因载体pGL3-promoter—MDBS，并将三个MDBS核心序列突变构建了突变的重组报告基因载体pGL3-promoter—MDBS。将pGL3-promoter—MDBS和pGL3-promoter—MDBS分别与Mipul的真核表达质粒pcDNA3．1-Mipul共转染小鼠巨噬细胞株Raw264．7或小鼠肌原细胞株C<,2>C<,12>，经荧光素酶测定发现，Mipul的过表达能抑制pGL3-promoter—MDBS的荧光素酶活性，并呈剂量依赖性，但不能抑制pGL3-promoter—MDBS的荧光素酶活性，表明Mipul具有转录抑制功能。 将Mipul开放阅读框的全长，或KRAB结构域或锌指(ZF)结构域分别与绿色荧光蛋白(GFP)融合，构建了pEGFP—Mipul、pEGFP—KRAB及pEGFP—ZF三个真核表达质粒。将它们导入C<,2>C<,12> 12小时后将细胞置荧光显微镜下观察。结果显示，Mipul的全长和KRAB定位于核，而空载体和ZF在细胞中呈散在分布。 本文进一步对Mipul调控的靶基因进行了初步分析。根据Mipul的DNA结合位点，经生物信息学分析发现，多个促凋亡基因启动子区含有该结合位点的核心序列。将其中Bax基因启动子的全长标上生物素后，Target detection assay显示，生物素标记的Bax的全长启动子能与GST-ZF及GST—ZF2相互作用，表明Bax是Mipul的潜在靶基因之一。综上所述，本研究得到如下结论：①Mipul是一个DNA位点特异性的核酸结合蛋白，其特异性的结合位点为5’-TGTCTTATCGAA-3’，核心序列为CTTA，C-末端的六个锌指为其与DNA结合所足够与必需；②Mipul是一个核蛋白，其核定位信号位于KRAB结构域或KRAB与锌指之间的连接序列中；③Mipul是一个转录抑制因子，可能通过抑制促凋亡基因的表达而抑制细胞凋亡，在细胞凋亡的发生过程中发挥调控作用。