法氏囊(bursa of Fabricus,BF)是禽类特有的体液中枢免疫器官,负责B细胞的发育和抗体的分泌。法氏囊活性肽BP5(Bursopentin)是从鸡BF中分离到的一种新的免疫活性肽,不仅能够调节体液免疫和细胞免疫反应,还具有抗氧化和抗肿瘤活性。目前,BP5抗肿瘤的作用机制尚不清楚。本研究旨在利用噬菌体展示技术,结合BP5诱导的肿瘤细胞基因表达谱分析及生物信息学分析,以期筛选出BP5肿瘤细胞相互作用蛋白并对其进行初步鉴定,同时初步揭示BP5抗肿瘤作用机制。本研究主要包括以下三个方面的内容:1、法氏囊BP5特异性结合肽的筛选及鉴定利用噬菌体展示技术,以BP5-BSA为靶分子对噬菌体随机12肽库进行4轮亲和筛选,结合ELISA鉴定和竞争抑制试验,筛选出3个BP5特异性结合肽,分别为:PINMQTLNCMAA(P2-12)、GCTLNPMSDLLG(P6-12)和MSSTLNGMLNSL(P7-12),其核心基序为TLNXM。采用MTT法检测其对BP5抗肿瘤细胞增殖能力的影响,结果显示,P2-12和P7-12肽在0.2-20μg/mL下,P6-12在2-20μg/mL浓度下均能抑制BP5抗小鼠WEHI-231细胞增殖作用,其中P2-12在2-20μg/mL浓度下抑制作用最显著(p<0.01)。此外,p53荧光素酶检测活性结果显示,3种BP5结合肽在实验浓度下均能下调BP5促p53基因转录活性。表明这3种BP5特异性结合肽均能下调BP5的抗肿瘤活性。为研究BP5的抗肿瘤作用机制奠定了基础。2、鸡DT40细胞c DNA T7噬菌体文库的构建及BP5鸡DT40细胞相互作用蛋白的筛选以鸡DT40细胞为肿瘤细胞模型,利用T7噬菌体展示技术构建鸡DT40细胞cDNA T7噬菌体文库,并以BP5-BSA为靶分子对文库进行亲和筛选,结合序列测定和生物信息学分析,筛选BP5鸡DT40细胞相互作用蛋白。结果显示,构建的鸡DT40细胞cDNA T7噬菌体文库原始滴度为1.2×104 pfu/mL,扩增后滴度达1.9×109 pfu/m L,文库重组率为91.7%,且插入片段大多在250-1000bp。随机选取12个PCR产物进行测序,结果显示插入序列均为鸡源序列。通过II三轮亲和淘选,结合序列测定获得3条与BP5结合的鸡源蛋白运输蛋白颗粒复合体2(TRAPPC2,trafficking protein particle complex 2)、血管内皮生长因子A(VEGFA,vascular endothelial growth factor A)和细胞周期蛋白E1(CCNE1,cyclin E1)。生物信息学分析发现鸡的TRAPPC2与小鼠和人的TRAPPC2的同源相似性分别为97.9%、100%,鸡的VEGFA与小鼠和人的VEGFA的同源相似性分别为76.8%、74.1%,鸡的CCNE1与小鼠和人的CCNE1的同源相似性分别为67.3%、71.3%,其中,VEGFA是血管生成的重要调控因子,CCNE1是调控细胞周期G1/S期的重要的细胞周期调节蛋白,二者的异常表达均与肿瘤的发生和发展密切相关,提示BP5的抗肿瘤作用可能与VEGFA和CCNE1相关,为进一步研究BP5肿瘤细胞相互作用蛋白提供科学依据。3、BP5刺激的鸡DT40细胞基因表达谱分析以BP5刺激鸡DT40细胞,通过基因芯片技术来分析BP5刺激后鸡DT40细胞中基因表达谱的变化情况。结果显示,BP5参与调节多条与抗肿瘤功能有关的通路,其中包括p53信号通路,且p53信号通路涉及的5个差异表达基因均与细胞周期调控或抗肿瘤相关,其中SIAH1、TP53(p53)、CIP1(p21)基因被上调,CHEK2、CCNE1基因被下调。BP5依赖p53肿瘤信号通路分析结果显示,在转录水平上,BP5在0.2-20μg/mL浓度下能够明显提高HCT116细胞中p53相对Luciferase活性,在蛋白表达水平上,BP5能显著促进p53、p21蛋白的表达水平,显著降低CCNE1和CHEK2蛋白的表达水平。结合BP5鸡DT40细胞相互作用蛋白筛选结果,初步鉴定为CCNE1是BP5肿瘤细胞相互作用蛋白候选蛋白,为进一步研究BP5抗肿瘤作用的分子机制提供了重要的依据。