选题依据:抑郁症是一种情感精神障碍疾病,临床表现主要为情绪低落、快感缺失、兴趣减退、精神迟滞、焦虑紧张等核心症状,以及注意力不集中、记忆力减退等认知症状,食欲不佳、疲劳乏力、性欲下降等躯体症状,具有高的复发率、致残率和自杀率。抑郁症的治疗仍以药物为主,而现有的一些抗抑郁化学药物存在着不良反应明显、患者依从性差等问题。中药不仅能够显著改善抑郁症核心症状,而且能改善一些抑郁症兼症,不良反应发生较少,逐渐受到国内外学者的广泛关注。因此,抗抑郁中药新药的研发具有十分重要的意义。课题组前期对逍遥散的抗抑郁组分进行筛选,并结合化学成分分析,通过对逍遥散化裁及提取工艺优化,去掉原方中的生姜、茯苓2味药,得到了柴归方,经水提醇沉相结合的工艺制备得到了柴归提取物,并在此基础上加入辅料制成柴归颗粒,目前已获得新药临床试验批件(2018L03149)。课题组前期不仅采用行为绝望、利血平拮抗、慢性温和不可预知应激(CUMS)、5-羟色胺(5-HT)诱导甩头等抑郁模型研究了柴归颗粒的抗抑郁作用,且对其能改善焦虑、学习记忆障碍、胃肠不适、性功能降低等抑郁症伴发症进行了探讨。从柴归颗粒对CUMS大鼠血清代谢物、炎性细胞因子、神经递质、神经内分泌激素、胃肠激素、性激素以及海马cAMP信号通路关键靶点的调节作用等方面对柴归颗粒抗抑郁作用机制进行了研究。然而,课题组对柴归颗粒抗抑郁作用在信号通路上的研究仅局限于cAMP信号通路,其是否可以影响其他信号通路发挥抗抑郁作用,尚不明确。因此,本课题进一步采用网络药理学和分子生物学(Real Time qPCR和Western blot)技术对柴归颗粒的抗抑郁作用机制进行深入研究。目的:本课题采用网络药理学方法对柴归颗粒抗抑郁作用机制进行研究,获取柴归颗粒发挥抗抑郁作用可能调节的重要信号通路。采用分子生物学(Real Time qPCR和Western blot)技术对网络预测结果进行验证。将本研究结果与前期研究结果进行整合分析,全面阐释柴归颗粒的抗抑郁作用机制。方法:1、基于网络药理学的柴归颗粒抗抑郁作用机制研究:采用网络药理学方法从柴归颗粒君药(柴胡)和复方两个角度探讨了柴归颗粒的抗抑郁作用机制,二者相互验证以获取柴归颗粒可能调节的重要信号通路。(a)通过TCMSP数据库、文献挖掘和本实验室已有研究获取柴胡主要活性成分,利用DRAR-CPI服务器、GeneCards和OMIM数据库预测和筛选柴胡活性成分抗抑郁的作用靶点;采用Cytoscape软件构建活性成分-作用靶点网络;采用String数据库和Cytoscape软件绘制蛋白相互作用网络;通过Systems Dock Web Site对成分与靶点进行分子对接验证;通过DisGeNET数据库对靶点所属的类型进行归属;采用DAVID数据库对靶点进行GO及KEGG通路分析,获取柴胡发挥抗抑郁作用可能调节的重要信号通路。(b)采用TCM database@Taiwan、TCMID、Batman-TCM数据库结合文献挖掘的方法收集柴归颗粒各单味药的化学成分;采用Batman-TCM数据库并结合CTD、TTD、OMIM、PharmGKB、Gencards、Drugbank数据库获取柴归颗粒抗抑郁作用靶点;采用String数据库和Cytoscape软件构建蛋白相互作用网络,进一步获取蛋白相互作用TOP20靶点;采用Cytoscape软件ClusterViz插件中的MCODE算法和Cluster Maker插件中的MCL算法分别对柴归颗粒蛋白相互作用网络进行模块分析,获取Score≥4模块和TOP1模块;采用DAVID数据库对柴归颗粒抗抑郁作用靶点的蛋白相互作用TOP20靶点、基于MCODE算法的TOP1模块和Score≥4模块的靶点、基于MCL算法的TOP1模块和Score≥4模块的靶点进行KEGG通路分析,获取柴归颗粒发挥抗抑郁作用可能调节的重要信号通路。2、柴归颗粒对CUMS模型大鼠海马PI3K/Akt信号通路的影响:(a)复制CUMS模型,通过体重、旷场(逃离中央格时间、穿越格数、直立次数)、糖水偏爱率等指标对柴归颗粒抗抑郁作用药效进行研究,获取海马样本用于后续实验验证;(b)采用Real Time qPCR方法对各组大鼠海马PI3K/Akt信号通路PI3K、Akt、mTOR、Foxo3a、GSK-3β、β-catenin的mRNA水平进行检测;(c)采用Western blot的方法对Akt、mTOR、Foxo3a、GSK-3β的蛋白水平进行检测。3、柴归颗粒抗抑郁作用机制整合分析:采用网络药理学方法对PI3K/Akt信号通路的结果与前期研究发现的柴归颗粒调节的差异代谢物、单胺类神经递质、cAMP信号通路关键靶点的结果进行整合分析。结果:1、网络药理学结果显示:柴胡抗抑郁作用靶点KEGG通路分析结果表明,PI3K/Akt信号通路可能在柴归颗粒君药(柴胡)抗抑郁过程中发挥重要的作用。柴归颗粒抗抑郁作用靶点的蛋白相互作用TOP20靶点、基于MCODE算法的TOP1模块和Score≥4模块的靶点、基于MCL算法的TOP1模块和Score≥4模块的靶点KEGG通路分析结果均表明PI3K/Akt信号通路可能在柴归颗粒抗抑郁过程中发挥重要的作用。2、Real Time qPCR结果显示:与空白对照组相比,模型组大鼠海马PI3K、Akt的mRNA水平显著降低(P<0.05,P<0.01),给予柴归颗粒后均能显著升高(P<0.05,P<0.05);模型组大鼠海马mTOR、β-catenin的mRNA水平显著降低(P<0.01,P<0.01),给予柴归颗粒后均能显著升高(P<0.01,P<0.01);模型组大鼠海马GSK-3β和Foxo3a的mRNA水平显著升高(P<0.05,P<0.05),给予柴归颗粒后能显著降低(P<0.01,P<0.01)。3、Western blot结果显示:与空白对照组相比,模型组大鼠海马Akt的蛋白水平显著降低(P<0.01),给予柴归颗粒后显著升高(P<0.01);模型组大鼠海马mTOR的蛋白水平有所降低,给予柴归颗粒后有所升高;模型组大鼠海马GSK-3β和Foxo3a的蛋白水平显著升高(P<0.05,P<0.05),给予柴归颗粒后显著降低(P<0.01,P<0.05)。4、整合分析结果显示:柴归颗粒可能通过调节PI3K/Akt信号通路影响葡萄糖代谢、乳酸代谢、胆碱代谢发挥抗抑郁作用,这种调节作用可能是由HK1、HK2、G6PC、PLD1、PLD2、LDHA等酶的变化引起的。柴归颗粒可能通过调节PI3K/Akt信号通路影响NE、5-HT代谢发挥抗抑郁作用,这种调节作用可能是由YARS、TH、BRPF1、TYR、TDO2酶的变化引起的。柴归颗粒通过调节PI3K/Akt信号通路和cAMP信号通路发挥抗抑郁作用,二者可能主要通过CREB、BDNF相关联。结论:1、网络药理学预测发现了柴归颗粒可能通过调节PI3K/Akt信号通路发挥抗抑郁作用。2、分子生物学技术验证了柴归颗粒可以通过调节PI3K/Akt信号通路PI3K、Akt、mTOR、Foxo3a、GSK-3β、β-catenin的mRNA水平和Akt、mTOR、Foxo3a、GSK-3β的蛋白水平发挥抗抑郁作用。3、整合分析部分结果表明了柴归颗粒能够通过调节代谢物、单胺类神经递质、信号通路关键靶点多层次的发挥抗抑郁作用。