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背景与目的:免疫原性细胞死亡(immunogenic cell death,ICD)可将死亡的癌细胞转化为治疗性疫苗,并刺激全身产生抗原特异性抗肿瘤免疫反应,相对于传统的免疫治疗方案,可以有效地改善免疫抑制性肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME),并提高免疫治疗的响应率。然而,由于诱导ICD的水平较低和缺乏针对肿瘤的靶向杀伤,传统的ICD诱导剂在抗肿瘤免疫治疗中的应用受到了限制。因此,寻找新的特异性靶向肿瘤的ICD强诱导剂是值得研究的重要领域。目前,对血液系统恶性肿瘤患者的过继性T细胞疗法(adoptive T cell therapy,ACT)已在临床实践中广泛使用,然而由于ACT在实体瘤中免疫应答效率低下和TME免疫抑制性作用,ACT在实体瘤中的疗效非常有限,研发新的有效的辅助治疗剂与ACT联合来增强ACT对实体瘤的治疗效应具有重要意义。本研究旨在研究七甲川花菁小分子IR-780作为靶向肿瘤的ICD诱导剂增强ACT对实体瘤的治疗效应。方法:体外实验部分,用CCK-8实验测定不同浓度IR-780对结直肠癌细胞株CT26增殖的影响。通过流式细胞术检测AnnexinⅤ和7-AAD共染不同浓度IR-780处理的CT26细胞的凋亡水平。利用IR-780的近红外荧光特性,与线粒体特异性荧光探针Mito-tracker Green共定位来确定IR-780的亚细胞定位。另外,利用ATP检测试剂盒、高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)的ELISA试剂盒及流式细胞术和免疫荧光染色检测ICD相关标志物。利用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)技术检测肿瘤细胞抗原提呈相关基因表达情况,利用免疫荧光染色来检测线粒体相关蛋白HSP90在细胞膜上的表达水平。并且,通过体外诱导骨髓来源的树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cell,BMDC)与IR-780处理过的CT26共培养24小时,利用流式检测BMDC成熟情况。动物实验共包括3部分:(1)用BALB/c小鼠建立小鼠结直肠癌CT26的皮下移植瘤模型,分别用IR-780及PBS治疗小鼠,每次给药时测量肿瘤长短径,并按公式计算体积。治疗结束后,颈椎脱臼处死小鼠后,剥取肿瘤组织称重。一部分肿瘤组织消化后制为单细胞悬液,流式检测肿瘤组织内浸润的免疫细胞;另一部分肿瘤组织固定后进行组织切片,用于免疫荧光染色检测ICD相关标志物CRT及CD3~+、CD8~+T淋巴细胞浸润情况。利用IR-780的近红外荧光特性,对IR-780组小鼠进行活体小动物近红外成像,检测IR-780的体内分布情况。(2)疫苗实验验证IR-780为一种新的ICD诱导剂,在BALB/c小鼠左侧背部注射分别用IR-780、米托蒽醌(mitoxantrone,MTX)、顺铂(cisplatin,CIS)预处理的CT26细胞,同时PBS作为对照组,一周后再在右侧背部注射未经任何处理的CT26细胞,在指定时间点观察BALB/c小鼠右侧背部肿瘤的形成率并测量肿瘤的大小。同样,在BALB/c小鼠右侧背部注射用IR-780预处理的CT26细胞,一周后进行尾静脉注射CT26细胞,20天后观察小鼠肿瘤肺转移的情况。(3)建立B16-OVA的小鼠荷瘤模型,分为Control组、IR-780治疗组、OT-1T细胞治疗组和OT-1+IR-780联合治疗组,IR-780治疗组与联合治疗组分别在第-3、-1、1、3、5天腹腔给予IR-780治疗,OT-1T细胞治疗与联合治疗组在第0天尾静脉给予OT-1T淋巴细胞治疗,在第10天观察结束后颈椎脱臼处死小鼠后,剥取肿瘤组织称重,并通过流式细胞术检测肿瘤组织内及小鼠肿瘤引流淋巴结内的免疫细胞,qRT-PCR检测肿瘤组织内CD8~+T细胞效应相关基因表达水平。结果:1.IR-780对结直肠癌的靶向杀伤作用:IR-780以浓度梯度依赖的方式抑制CT26细胞增殖和诱导细胞凋亡。近红外荧光显微镜检测到IR-780特异性蓄积在肿瘤细胞,共聚焦显微镜发现IR-780的定位于细胞线粒体。在动物实验中,IR-780能够明显抑制肿瘤的生长。用Kodak In-Vivo FX professional Imaging System对IR-780处理的荷瘤小鼠进行成像,结果显示IR-780特异性地蓄积于肿瘤组织。2.IR-780诱导小鼠结直肠癌免疫原性细胞死亡:ATP、HMGB1释放至胞外的量均较对照组高,CRT的胞膜表达水平也较高。IR-780处理组的HSP90的胞膜表达水平以及抗原提呈基因表达水平均比对照组高。共培养后BMDC的成熟比例明显增加。通过疫苗实验证明IR-780是一种新的ICD诱导剂,并通过流式细胞术及免疫荧光染色发现IR-780治疗组肿瘤内浸润T淋巴细胞增多。通过疫苗作用能够抑制小鼠结直肠癌肺转移结节的形成。3.IR-780增强ACT在小鼠实体瘤肿瘤模型中的作用:IR-780和OT-1T细胞联合治疗组能够显著抑制肿瘤生长,流式结果证明肿瘤组织内及引流淋巴结内的具有杀伤效应的CD8~+T淋巴细胞比例也是联合治疗组最高。此外,qRT-PCR也得到相似的结果,即联合治疗组CD8~+T淋巴细胞杀伤效应相关基因表达最高?结论:1.IR-780能有效抑制结直肠癌细胞的增殖并诱导其凋亡,能显著抑制结直肠癌细胞株CT26的小鼠移植瘤模型中的肿瘤生长。IR-780能特异性地蓄积在肿瘤细胞,靶向肿瘤细胞线粒体。2.IR-780能够诱导小鼠结直肠癌免疫原性细胞死亡,增加肿瘤内T淋巴细胞的浸润。通过疫苗作用能够抑制小鼠结直肠癌肺转移结节的形成。3.IR-780能够增强ACT对B16-OVA移植瘤模型中的肿瘤生长的抑制作用,能够增强CD8~+T淋巴细胞的功能。