拟穴青蟹(ScyllaParamamosain)为我国南方主要的经济养殖品种之一。随着养殖规模日渐扩大及养殖密度的增高,青蟹传染疾病频发,给养殖业造成了巨大的经济损失。目前,由于对拟穴青蟹免疫系统及免疫相关基因的认识有限,拟穴青蟹养殖中的疾病防控研究一直处于初级阶段。为了充分了解青蟹免疫系统,更好地为青蟹健康养殖服务,本论文以拟穴青蟹养殖中的常见细菌病害-副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)感染青蟹,研究青蟹转录组及V.parahaemolyticus感染下的青蟹差异表达谱,并在此基础上进一步研究重要的免疫相关基因。论文获得研究结果具体如下:　　1、副溶血弧菌刺激拟穴青蟹血细胞的转录组文库　　使用高通量测序技术SolexaHiseq2000和生物信息学方法分析了副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)刺激拟穴青蟹血细胞的转录组文库,得到52,934,042条原始Cleanreads,总核苷酸数为4,764,063,780bp,对原始reads进行拼接组装,得到186,193条Contig,进一步组装成81,709条Unigene,Unigene的平均长度为656bp。　　Unigene与Nr数据库、Swissprot数据库、GO分类和COG数据库比对,分别有23,978、20,147、10,566和9,135条得到功能注释。这些转录本中,有25,349条Unigene参与了258个已知的代谢或信号通路。　　2、副溶血弧菌刺激的拟穴青蟹血细胞数字基因表达谱　　利用RNA-Seq数据,比较了副溶血弧菌刺激的拟穴青蟹血细胞样品和正常对照的拟穴青蟹血细胞样品,获得了1213个差异表达基因,包括538个上调表达基因和675个下调表达基因。进一步筛选得到96个与免疫和信号转导相关的基因。这些基因大致上可分为细胞增殖与细胞炎症、转导与调节活性、蛋白代谢、细胞因子与催化因子和免疫相关五类。　　使用数据库GeneOntology和GenMAPP软件对1213个基因进行分析,发现拟穴青蟹多个信号通路在副溶血弧菌感染过程中发生变化,其中包括趋化因子、JAK-STAT和MAPK信号通路。通过Real-timePCR验证了若干个差异表达基因。这些结果有利于进一步全面地了解拟穴青蟹应答副溶血弧菌刺激的免疫机制。　　3、SpTSP基因克隆及生物信息学分析　　四次跨膜蛋白分子(tetraspanin,TSP)是上世纪九十年代初发现的一类小分子糖蛋白。TSP在分子内部可与其它蛋白相互作用,对各种基本的细胞生理过程进行调控,如细胞分化、细胞移行、细胞凝集、细胞溶解和信号转导等。本研究根据前面转录组测序得到的部分TSP的核苷酸片段,通过RT-PCR结合cDNA末端快速扩增RACE技术,成功克隆了拟穴青蟹四次跨膜蛋白分子基因TSP的全长cDNA,并对其进行了初步的生物信息学分析。结果表明SpTSP基因cDNA全长860bp,包括5’和3’非编码序列分别为2bp和224bp,开放阅读框序列534bp,编码177个氨基酸。SpTSP在分类学上与无脊椎动物昆虫类属于同一子群,跟脊椎动物TSP亲缘关系较远。SpTSP基因广泛表达于青蟹不同组织中,在中肠组织中相对表达量最高。拟穴青蟹经副溶血弧菌胁迫后,血细胞中TSP基因的表达表现为先下降后上升的趋势,18h表达量最低。推测SpTSP在拟穴青蟹体内可能参与消化、代谢、免疫防御等多种生物学功能。　　4、SpAST基因克隆及生物信息学分析　　造血激素(astakine,AST)是节肢动物中具有促进造血组织细胞分化和增殖的一种细胞因子。造血激素在甲壳类免疫防御反应中可能起着十分重要的作用。本研究根据转录组测序得到的部分AST的基因片段,通过RT-PCR结合cDNA末端快速扩增RACE技术,成功克隆了拟穴青蟹造血激素基因AST的全长cDNA。生物信息学分析表明SpAST基因cDNA全长533bp,5’和3’非编码序列分别为9bp,和176bp,开放阅读框348bp,编码115个氨基酸。SpAST在分类学上与甲壳类动物亲缘关系较近,跟哺乳动物AST亲缘关系较远。SpAST基因广泛表达于青蟹不同组织中,在肝胰腺和中肠组织中相对表达量较高。拟穴青蟹经副溶血弧菌胁迫后,血细胞中AST基因的表达水平总体趋势为上调,114h表达量最高。这些结果为进一步研究拟穴青蟹免疫功能基因的表达规律及功能奠定了基础。