在血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)诱导的血管生成中，骨髓来源的内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)的募集和捕获起着关键作用。EPCs的动员和分化被另一个重要的趋化因子——基质细胞衍生因子-1(Stromal cell—derived factor-1α，SDF-1α/CXCL12)所调控。因此我们设想在由EPCs介导的血管发生过程中，如果结合SDF-1α和VEGF的作用，可能会有助于增加新生血管生成通路。我们的研究首次将VEGF165基因修饰的EPCs和SDF-1α联合应用于后肢缺血小鼠的治疗。通过体内、体外实验提出了二者存在协同作用的可能性，为临床缺血性疾病的治疗拓开了思路。通过体外实验明确了VEGF165的高表达能促进SDF-1α介导的EPCs的迁移，而SDF-1α又能显著抑制人VEGF165基因修饰的EPCs(hVEGF165-EPCs)的凋亡；通过动物实验证实了联合hVEGF165-EPCs和SDF-1α能改善血管生成的微环境，促进微血管生成，增加缺血组织血流灌注；初步探讨了hVEGF165-EPCs和SDF-1α联合治疗的作用机制。实验从mRNA水平证实VEGF上调EPCs的CXCR—4表达，而阻断CXCR—4能抵消SDF-1α所介导的hVEGF165-EPCs的迁移，表明VEGF通过上调CXCR—4表达促进SDF-1α介导的EPCs迁移。 本研究表明，在EPCs诱导的新生血管形成中，SDF-1α和VEGF可能存在的协同生血管通路机制至关重要，针对VEGF和SDF-1α信号的共同靶点可能为缺血性疾病的治疗提供一种新的、更为有效的策略。 1.人外周血内皮祖细胞体外诱导培养、扩增和鉴定 采用密度梯度离心法分离出成人外周血中的单个核细胞(Human peripheral blood mononuclear cells，hPBMCs)，将细胞接种在纤维连接蛋白(Fibronectin，FN)包被的培养板中，用内皮祖细胞培养基(EndoCultTM液体培养基)诱导培养。2天后，收集悬浮细胞重新接种至包被了FN的培养板中，继续培养3天。 培养5天的细胞内吞乙酰化低密度脂蛋白(acetylated low density lipoprotein，ac—LDL)结合荆豆凝集素-1(Ulex europaeus agglutinin，UEA-1)，显示双阳性；内皮细胞标志物Ⅷ因子相关抗原(von Willebrand factor，VWF)阳性。流式细胞仪检测，CD133+细胞率为67.82±0.54％。 2.VEGF165基因逆转录病毒感染人外周血内皮祖细胞 将重组质粒扩增、纯化，转染293-GPG(VSV—G)病毒包装细胞，获取携带pBABE—VEGF165的逆转录病毒载体(Td/V)。用逆转录病毒上清液感染EPCs。混合感染液培养3h后，PBS轻柔清洗，加入EPCs培养液培养24h，待用。 为衡量感染效果，将转入了VEGF165基因的EPCs植入裸鼠体内，观察裸鼠体内不同时间点的血浆VEGF165浓度水平。 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测显示，静脉注入TdN—EPCs的裸鼠外周血VEGF165浓度在不同时间点都高于空载体组(Td/p—EPCs)。 3.SDF-1α影响人外周血内皮祖细胞迁移、凋亡的体外实验 EPCs的迁移是血管新生的关键步骤。本研究中，我们通过体外Transwell实验观察了VEGF和SDF-1α促使的EPCs迁移。在Transwell板下室加入EndoCultTM全培养液，添加0.1％BSA；按实验分组，在下室中加或不加SDF-1α(100ng/ml)，使下室液体终容积为30μl；分别收集EPCs，Td/p—EPCs和Td/V—EPCs制备细胞悬液，用50μl EndoCultTM全培养液(添加0.1％BSA)重悬细胞加入Transwell小室。 为阻断CXCR—4受体通路，Td/V—EPCs预先加入CXCR—4特异性拮抗剂AMD3100(5μg/ml)，37℃孵育30min。 研究显示各组细胞中，添加了SDF-1α的细胞迁移能力明显强于未添加孔，而在添加了SDF-1α的细胞组中，细胞迁移能力Td/N—EPCs明显强于Td/p—EPCs和EPCs。VEGF和SDF-1α促使的EPCs迁移可被CXCR—4特异性拮抗剂AMD3100抵消。 Td/V—EPCs同Td/p—EPCs、EPCs间CXCR—4在mRNA水平上的表达存在显著性差异，TdN—EPCs的CXCR—4mRNA表达水平高于Td/p—EPCs和EPCs。 EPCs的存活对保持稳定的新生血管形成至关重要。我们采用饥饿诱导凋亡(3％FBS EndoCultTM液体培养基)的方法，观察VEGF和SDF-1α是否能协同促进EPCs的存活。AnnexinV—FITC/PI双染法检测凋亡细胞百分率。 结果显示，单一因素SDF-1α或Td/V—EPCs组同各自对照组(EPCs或Td/p—EPCs)的细胞凋亡比率存在显著性差异(P<0.01)，前者降低凋亡比率；双因素TdN—EPCs+SDF-1α组分别同单一因素SDF-1α组及Td/V—EPCs组的细胞凋亡比率存在显著性差异(P<0.001)，Td/V—EPCs+SDF-1α组减少细胞凋亡。实验结果表明，双因素VEGF和SDF-1α的存在，能最大限度的降低细胞凋亡比率。 VEGF和SDF-1α能促进EPCs迁移能力，减少EPCs的凋亡。VEGF和SDF-1α的协同作用可能存在多重机制。随着研究的不断进展，在众多参与血管生成调控过程的趋化因子中，VEGF、SDF-1/CXCR—4轴在血管新生等方面的重要作用将越来越被人们所关注。 4.SDF-1α联合VEGF165修饰的人外周血内皮祖细胞治疗小鼠后肢缺血的研究 实验选用BALB/C—nu/nu雌性裸鼠，8～10周龄，体重17～22g。10％水合氯醛腹腔注射麻醉，外科手术显微镜下分离结扎股动脉及各分支。结扎近、远端股动脉并切断，注意必须结扎并切断股深动脉。彩色激光多普勒血流灌注成像仪(Laser Doppler perfusion imaging，LDPI)检测裸鼠后肢血流。血流灌注量数值从低到高分别由不同的颜色表示，红色区域表示为最大血流灌注，黄色为中等量血流灌注，蓝色表示较低的血流灌注。获取的数码图像记录了检测区域的血流灌注量绝对值(readable units，RU)。按实验分组给药治疗。 示踪：CM—Dil标记细胞。处死裸鼠前30min，经尾静脉注入FITC标记的BS-1(Bandeiraea simplicifolia lectin-1)。荧光显微镜下，显示红色荧光的为EPCs，裸鼠微血管内皮显示绿色荧光。 结果显示：联合治疗组(肌注SDF-1α，静注Td/V—EPCs)患肢腓肠肌切片微血管密度与其他各组存在显著性差异，联合治疗组微血管密度高于其他各组。对募集到患肢的EPCs和裸鼠微血管内皮细胞定量分析显示，不论是EPCs还是裸鼠微血管内皮细胞密度，联合治疗组均高于其他各组。 LDPI采集每组裸鼠患肢和健肢的RU(readable units，RU)比值，取平均值。结果显示联合治疗组患肢RU比值与其他各组在各个时间点存在显著性差异，联合治疗组患肢RU比值高于其他各组。 在这部分实验中，我们首先制作了裸鼠后肢缺血模型，然后利用如前所述培养的EPCs及VEGF165基因修饰的EPCs行静脉移植，同时局部肌肉注射SDF-1α，观察裸鼠新生血管形成和侧枝循环的建立情况。我们首次证实经静脉移植过表达hVEGF165的EPCs联合局部肌肉注射SDF-1α，对局部组织缺血的治疗效果要优于单一因素。研究证实，通过联合治疗，能促进EPCs的动员、内皮细胞的增殖和更显著的血管形成反应、减少组织损害，增加缺血后肢功能。 总之，我们的实验结果显示，联合SDF-1α和静脉移植过表达VEGF165的EPCs治疗缺血性疾病，其效果优于任一单一治疗。本研究表明，在EPCs诱导的新生血管形成中，SDF-1α和VEGF可能存在的协同生血管通路机制至关重要，针对VEGF和SDF-1α信号的共同靶点可能为缺血性疾病的治疗提供一种新的、更为有效的策略。