家兔急性肺动脉栓塞时HO-1表达的研究

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目的:采用家兔颈外静脉注入自体血栓建立急性肺动脉栓塞动物模型,探讨HO-1及5-HTT在家兔发生急性肺动脉栓塞时的表达规律,分析两蛋白表达的关联性,探讨HO-1在急性肺动脉栓塞中的机理及其作用机制。方法:本实验选取健康家兔36只,随机分为正常对照组(n=4),PE模型组(n=16),诱导剂组(n=16)。PE模型组采用家兔耳缘静脉采血,用以制作家兔肺动脉栓塞模型的自体血栓,自家兔颈外静脉插管注入自体血栓,在家兔出现呼吸加深加快栓塞征兆时,抽取颈动脉血检测血氧饱和度,当血氧饱和度小于90%,视为造模成功。诱导剂组采用腹腔注射钴原卟啉(COPP),注射剂量为实验家兔2.5ml/kg,24h后与PE模型组造模方式一致,制作肺动脉栓塞模型。所有实验家兔于造模成功后0h、3h、8h、24h处死,并迅速取出肺组织,观察肺组织的大体组织变化后,生理盐水充分冲洗,切取部分肺组织于RNA保护液中,余组织放入4%甲醛溶液中固定。通过HE染色观察肺组织在造模成功后不同时间段的形态变化,以及免疫组织化学法及荧光定量PCR法检测HO-1、5-HTT在肺栓塞后不同时间的表达量,结果统计分析,探讨HO-1及5-HTT在急性肺栓塞时肺组织中的表达的规律及作用机理。结果:1.光镜下观察HE染色结果显示,正常对照组肺组织在光镜下组织结构清晰可辨,排列均匀,肺动脉内未见栓子;肺动脉栓塞时不同时间段肺动脉内均可见栓子栓塞,且肺泡结构可见不同程度的缺氧改变,栓塞3h后,肺泡腔内可见炎性细胞的浸润,肺动脉壁有明显的充血及水肿现象;诱导剂组各组均较肺栓塞组肺组织结构破坏程度减轻。2.免疫组织化学检测结果显示:正常对照组HO-1蛋白的表达基本呈阴性,PE模型组HO-1蛋白的表达均呈现阳性,较对照组有统计学意义(P<0.05)。PE模型组HO-1蛋白的表达在24小时内随着时间的延长,呈现一个逐渐递增的趋势,其中0h与3h之间无明显递增趋势,其差异性不具有统计学意义(P>0.05)。诱导剂组HO-1的表达较正常对照组和PE模型组有明显升高趋势(P<0.05),但其各组之间没有明显的趋势变化(P>0.05)。正常对照组5-HTT蛋白的表达为阴性,PE模型组5-HTT的表达在造模后0h、3h、8h均呈现阳性,较正常组蛋白表达量高(P<0.05),但在24小时内呈现一个先增高,后降低的趋势。造模后5-HTT表达有一个高峰,3h已经降低,24h后基本降至正常水平(P>0.05)。诱导剂组5-HTT蛋白的表达较模型组0h、3h、8h组低(P<0.05),但各组织间蛋白表达不具有统计学意义(P>0.05)。3.荧光定量PCR检测结果表示:用2-ΔΔCtt得到的数值(样本基因的相对定量)做统计分析,表示每组样本基因是正常组的倍数。HO-1的表达,以正常对照组2-ΔΔCt值(1.000±0)为基准,各组2-ΔΔCt值与其相比较:PE模型组0h组是其(2.548±0.569)倍(P<0.05),3h组是其(3.188±1.186)倍(P<0.05),8h组是其(5.357±0.750)倍(P<0.05),24h组是其(9.549±1.391)倍(P<0.05)。诱导剂0h、3h、8h、24h组HO-1是正常组的(11.144±1.750)、(12.238±1.196)、(13.034±1.409)、(13.416±0.767)倍,均较正常组升高(P<0.05)。5-HTT的表达,以正常对照组2-ΔΔCt值(1.000±0)为基准,各组2-ΔΔCt值与其相比较:PE模型组0h组是其(8.601±0.563)倍(P<0.05),3h组是其(6.742±0.951)倍(P<0.05),8h组是其(5.691±1.028)倍(P<0.05),24h组是其(2.610±0.763)倍(P>0.05)。诱导剂0h、3h、8h、24h组5-HTT是正常对照组的(2.569±0.754)、(2.502±0.976)、(2.144±0.690)、(2.531±0.766)倍,较PE模型组0h、3h、8h组降低(P<0.05),与PE模型组24h组之间没有统计学意义(P>0.05)。结论:本实验以正常组为对照,建立了PE模型组和诱导剂组,并在每组间设定0h、3h、8h、24h时间段观察各组肺组织的病理形态变化,用HO-1、5-HTT蛋白的表达变化反应表达趋势。1.PE模型组各组较正常对照组组织形态有明显的改变,而在HO-1诱导剂组中,虽然形态较正常组仍有改变,但同一时间段,诱导剂组的组织形态较PE模型组形态变化较小,说明诱导剂在肺动脉栓塞过程中起到一个保护的作用。2.与正常组对照组相比,PE模型组的HO-1蛋白在24h内的表达呈现一个逐渐升高的趋势,表明肺动脉栓塞时,HO-1的表达随之发生增加,且免疫组化的结果显示棕黄色颗粒主要集中于肺动脉内皮细胞、肺动脉平滑肌细胞和肺泡巨噬细胞,说明HO-1的表达与血管关联。而5-HTT蛋白的表达与正常组相比,呈现一个先增加后降低的趋势,说明在肺栓塞过程中5-HTT的表达随着时间的延长,其表达受到抑制;在诱导剂组中,5-HTT的表达较正常组明显减少,说明5-HTT在肺动脉栓塞的表达可能受到HO-1表达水平的抑制。3.由免疫组化的棕黄色阳性结果的定位以及荧光定量PCR的值可以看出,5-HTT随着HO-1的增加,而呈现一个下降的趋势,两者的相互作用在肺动脉栓塞的发生发展过程中有重要的意义,对肺动脉栓塞的发生机制的研究以及疾病的预防和治疗有着非常重要的作用。
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