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目的:建立新生大鼠缺氧缺血性脑损伤((Hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)模型及 PC12 细胞糖氧剥夺(Oxygen and glucose deprivation,OGD)模型,检测 HIBD后松果体及OGD后PC12细胞miR-9a-5p的表达情况;荧光素酶实验检测到miR-9a-5p靶基因clock后,进一步分析HIBD后松果体及OGD后PC12细胞中clock mRNA及蛋白的表达情况;miR-9a-up慢病毒及miR-9a-5p抑制剂转染PC12细胞,探讨miR-9a-5p与clock之间的调控机制;左侧侧脑室注射LV-rno-mir-9a-1,通过水迷宫、旷场实验及新物体识别等实验,研究miR-9a-5p表达对大鼠远期神经认知的影响。方法:采用7日龄SD新生大鼠,根据改良Rice-Vannucci法建立HIBD模型,按随机分配原则,分为假手术组(Sham组)、缺氧缺血组(HIBD组)。PC12细胞行糖氧剥夺(OGD)的处理方法,模拟缺氧缺血模型。MAP2免疫荧光测定PC12细胞神经元特性;采用RT-qPCR法检测大鼠HIBD后及PC12细胞氧糖剥夺后miR-9a-5p,Aanat,clock、per1、cry1、baml1表达情况;Western blot 法检测 clock、per1、cry1、baml1蛋白表达情况;ELISA法检测大鼠外周血及细胞培养基褪黑素(MT)水平变化。miR-9a-up慢病毒及miR-9a-5p抑制剂转染PC12细胞后,检测上述指标。RT-qPCR检测注射LV-rno-mir-9a-1后3月龄SD大鼠松果体中miR-9a-5p及clock mRNA的表达情况;然后,对3月龄SD大鼠行Morris水迷宫实验、矿场实验、新物体识别实验。研究结果:1、HIBD后0h、12h、24h、36h、48h 5个时间点松果体中miR-9a-5p表达均高于相应时间点 Sham 组(P<0.05);HIBD 后 24h、36h、48h 松果体中 AanatmRNA表达高于相应时间点Sham组(P<0.05);MT的分泌在HIBD后12h、24h、36h、48h明显低于对应时间点Sham组(P<0.05)。在OGD后12h、24h、36h、48h,PC12细胞中miR-9a-5p表达高于正常细胞(P<0.05),同时MT分泌低于正常细胞(P<0.05)。2、通过双荧光素酶实验检测发现miR-9a-5p的靶基因为clock。RT-qPCR及Western blot实验发现HIBD后5个时间点松果体中clock mRNA及蛋白表达均低于相应时间点 Sham 组(P<0.05);OGD 后 12h、24h、36h、48h PC12 细胞中 clock mRNA表达低于正常细胞(P<0.05),clock蛋白在OGD后5个时间点表达均低于正常细胞(P<0.05);哺乳动物生物钟中心的其他钟基因per1、cryl、baml1的mRNA及蛋白在HIBD后松果体及OGD后PC12细胞中表达下调。3、miR-9a-up慢病毒转染PC12细胞后,miR-9a-5p表达明显高于对照组细胞(P<0.05);MT分泌降低,clock、per1、cry1、baml1的mRNA表达均低于对照组细胞(P<0.05)。miR-9a-5p抑制剂转染PC12细胞后,miR-9a-5p抑制剂转染+OGD组细胞的clock、perl、cry1、baml1 mRNA表达高于miR-9a-5p抑制剂对照转染+OGD组细胞(P<0.05);MT在转染成功后72h分泌升高(P<0.05)。4、左侧侧脑室注射LV-rno-mir-9a-1后,SD大鼠3月龄时RT-qPCR检测松果体内miR-9a-5p处于高表达,其靶基因clockmRNA处于低表达。5、在Morris 水迷宫实验中,大鼠通过游泳强化训练后,平均逃避潜伏时间逐渐下降,miR-9a-up组与CON253组相比穿越平台次数明显减少(P<0.05);在旷场实验中,miR-9a-up组大鼠活动路程及进入中央区域的次数明显大于CON253组大鼠(P<0.05),两组大鼠的平均运动速度比较差异无统计学意义(P<0.05);在新物体识别实验中,CON253组大鼠对新物体的探索时间比miR-9a-up组大鼠长(P<0.05),在对新物体探索次数上也比miR-9a-up组大鼠多(P<0.05);以上说明miR-9a-5p过表达后,可能损害脑组织,使情绪焦虑、学习记忆能力降低。结论:1、HIBD后松果体中miR-9a-5p表达上调,AanatmRNA表达下调,同时MT分泌降低,miR-9a-5p可能参与HIBD后松果体的损伤。2、miR-9a-5p的靶基因为clock,clock为哺乳动物生物钟组成部分,结合MT的异常分泌,我们发现HIBD后miR-9a-5p通过靶向调控clock,影响生物钟其他钟基因的异常表达,从而参与到松果体的损伤和功能异常。3、SD大鼠松果体miR-9a-5p过表达后,可导致其学习认知能力下降、情绪焦虑,表明miR-9a-5p可参与松果体损伤病理生理过程。