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实验一小鼠腹腔异位心脏移植模型的建立目的:快速掌握稳定的小鼠腹腔异位心脏移植模型的建立方法:有针对性分阶段练习建立心脏移植模型,显微训练前后期,供、受体都采用昆明鼠,模型稳定期时供、受体分别为近交系BALb/C(H-2d)小鼠和近交系C57BL/6(H-2d)小鼠。手术过程:同时麻醉供、受体,获取供心冰水里保存,阻断受体主动脉和下腔静脉后,将供心的主动脉和肺动脉分别同受体的腹主动脉和下腔静脉作端侧吻合,开放血流后关腹,术后复温苏醒。结果:显微训练前、后期和模型稳定阶段手术成功率分别为16.00%,54.00%和86.67%,随着训练阶段进行成功率逐步提升,且手术各部分时间明显缩短。显微训练前期死亡因素多为动脉、静脉吻合问题,发生率分别为42.00%和14.00%;训练后期死亡原因多为动脉血栓,发生率为12.00%。结论:分阶段有目的的练习有利于较短时间内掌握模型建立,避免了实验动物的浪费。重视每一步细节是保证手术成功的关键。实验二PI3K ⅠA类抑制剂在小鼠心脏移植急性排斥反应中的作用及机制研究目的:研究应用PI3K ⅠA类抑制剂对小鼠心脏移植排斥反应的作用,探讨其作用机制。方法:建立同种异体移植模型和同系移植模型,Western Blot检测两组心脏移植物中p110α/β/δ表达情况。建立同种移植模型,随机分为四组:对照组,腹腔注射0.5%DMSO作为对照,PIK组、TGX组和IC组分别腹腔注射p110α/β/δ选择性抑制剂PIK-75、TGX-211和IC-87114。观察移植物存活时间。术后第7天取受体体内移植物作组织病理学检查,评分分级;流式细胞术检测受体脾脏中Th1,Th2,Th17和Tfh,Treg比例;ELISA检测受体外周血中IFN-γ、IL-10、IL-17A、IL-21和TGF-β表达水平;Western Blot检测心脏移植物AKT/m TOR通路关键蛋白的磷酸化情况。结果:与同系移植组相比较,同种异体移植物组p110α仅在第7天时表达明显上调(p<0.05),而p110β和p110δ蛋白的表达水平在第5天和第7天都明显上调(p<0.05);与DMSO组比较,IC组和PIK组移植物存活时间明显延长(P<0.01),病理分级程度下降(P<0.01),TGX组不能明显延长存活时间,病理分级与对照组无统计学差异(P>0.05);PIK可以降低受体脾脏中Th1和Tfh/单核细胞的比率(P<0.05),TGX可以降低Th2和Tfh/单核细胞的比率(P<0.05)。更重要的是IC不仅可以降低Th1/单核细胞的比率(P<0.01)和Th2、Th17与Tfh/单核细胞的比率(P<0.05)。还可以提升CD4+T细胞中调节性T细胞(Treg)的百分率(P<0.01);PIK组外周血中IFN-γ和IL-21明显降低(P<0.01),IL-17A也降低(P<0.05),但是IL-10表达显著升高(P<0.01)。TGX组IL-21明显降低(P<0.01),且IFN-γ和IL-17A也降低(P<0.05)。IC组IFN-γ明显降低(P<0.01),且IL-17A和IL-21也降低(P<0.05),但是IL-10和TGF-β表达升高;三种抑制剂不能明显改变总的AKT表达,但不同程度抑制AKT1磷酸化。IC可以显著的抑制p70 S6K和4E-BP1的表达,PIK和TGX作用较弱,且IC和PIK处理还抑制p70 S6K和4E-BP1的磷酸化。结论:p110δ/α小分子抑制剂均能抑制小鼠心脏移植急性排斥反应,可能与其通过不同程度影响AKT/m TOR下游信号通路蛋白表达及磷酸化,从而调节体内CD4+T淋巴细胞亚群比例分布,降低促炎因子或增加抗炎因子水平发挥抗排斥作用。