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石油质原料的塑料制品广泛用于人们的生产生活中,但因其难降解性导致废弃物长期残留,使得环境污染严重。聚β-羟基丁酸酯(poly-β-hybroxybutyricacid,PHB)及其混溶物具有与石油质塑料类似的物化性质及加工性质,而且具有生物降解性、组织相容性等特性,是石油质塑料的优良替代品。目前PHB工业化规模较小,产品价格昂贵是限制其推广应用的主要瓶颈问题。PHB与高附加值产物共合成将会有效降低PHB生产成本。四氢嘧啶(1,4,5,6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidinecarboxylic acid, Ectoine)是某些微生物应答环境渗透压胁迫所合成的一种渗透压补偿性溶质,作为细胞保护剂、生物制剂稳定剂、药物制剂、化妆品添加剂,具有较高的商业附加值。PHB和Ectoine在一个发酵过程中同时合成(PHB/Ect共合成)的制备技术,显示了降低生产成本、提高生产效率、推动PHB和Ectoine工业化生产和商业化应用的巨大潜力,日益受到研究者的关注和重视。目前应用于微生物PHB/Ect共合成研究的野生型菌株以中度嗜盐菌居多,其中Halomonas属中就有多个种已被用于该项研究,但是目前报道的研究结果表明,这些菌种还没能有效的解决PHB/Ect共合成生产效率低下,生产成本高,价格昂贵等问题。Halomonas属中的Ectoine分泌型菌株能够在较低的NaCl浓度下合成并部分分泌Ectoine;生长平衡期细胞仍能高效合成Ectoine; Ectoine的分泌使细胞内Ectoine浓度≤胞内浓度阈值,从而解除了其合成途径的负反馈调节作用,实现Ectoine超量合成。该类菌株的以上特性对于解决目前PHB/Ect共合成存在的问题优势显著,揭示Ectoine分泌机理,对于进行分泌型菌株Ectoine合成的代谢调控、提高Ectoine合成量,进而进一步提高PHB/Ect共合成效率具有重要意义。本文研究Ectoine分泌型菌株的Ectoine分泌机理,选择低渗冲击耐受性的Ectoine分泌型菌株Halomonas venusta DSM4743,考查其Ectoine分泌特征、优化其PHB/Ect共合成条件,并进行基于发酵动力学模型分析的底物流加发酵,构建PHB/Ect共合成产物循环制备体系。具体研究内容及成果如下：1. Ectoine分泌型菌株分泌Ectoine机理研究。揭示了菌株Halomonas salinaDSM 5928分泌Ectoine的机理,建立了推广的Kunte模型。分泌型菌株Ectoine释放能力大于吸收能力,即Ectoine输出量>吸收量；teaA基因的mRNA表达丰度较小,TeaA蛋白对Ectoine结合率低,因此经TeaA结合、吸收至胞内的Ectoine量较少,表现为分泌Ectoine。在此基础上,提出了揭示Ectoine分泌机理的推广的Kunte模型。2.选取应用于PHB/Ect共合成的Ectoine分泌型菌株,优化该菌株Ectoine合成条件。基于H. venusta DSM 4743具有低渗冲击耐受性的优点,选取该菌株为PHB/Ect共合成研究的菌株。’H-NMR鉴定其分泌产物为Ectoine。优化该菌株合成Ectoine的条件为：以80 g/L谷氨酸单钠为碳源,30g/LNaCl诱导。优化条件下Ectoine合成量为299.5 mg/g CDW,分泌量为224.6 mg/g CDW,分泌率达到75%。3. H. venusta DSM 4743合成PHB的鉴定及条件优化。经1H-NMR鉴定,菌株H. venusta DSM 4743能够合成PHB。通过碳源种类比较确定H. venusta DSM 4743能够利用甜菜糖蜜合成PHB。优化的PHB合成条件为：NaCl浓度为30 g/L,甜菜糖蜜浓度为160 g/L、碳氮比为15、磷酸盐添加量为3 g/L KH2PO4和9g/L K2HPO4,初始pH 7.2。该条件下PHB合成量达到7.8 g/L。相同条件下在细胞生长平衡期限制供氧有利于PHB的合成,PHB合成量可提高到8.1 g/L4. H. venusta PHB/Ect共合成条件优化及基于分批发酵动力学模型分析的底物流加发酵。优化H. venusta DSM 4743 PHB/Ect共合成条件,结果表明以110 g/L糖蜜和25 g/L谷氨酸单钠为混合碳源,NaCl浓度为30 g/L,磷酸盐添加量为3 g/LKH2PO4和9g/L K2HPO4,有利于PHB/Ect共合成。优化条件下利用发酵罐进行该菌株PHB/Ect共合成分批发酵,发酵28 h后,Ectoine和PHB合成量均达到最大值,分别为4.2g/L和14 g/L。根据分批发酵过程曲线,建立PHB/Ect共合成分批发酵动力学模型。在动力学模型分析基础上,进行优化条件的底物流加发酵,PHB总合成量为32.1g/L,Ectoine总合成量为8.6g/L,最大细胞干重达41.3 g/L,得率为0.31g/g。5.构建基于低渗冲击的PHB/Ect共合成产物循环制备体系。1H-NMR鉴定H.venusta DSM 4743释放的PHB产物,优化低渗冲击释放PHB的条件,建立基于低渗冲击的PHB/Ect共合成产物循环制备体系。在该体系中PHB的平均合成量为7.0g/L/循环,PHB的总合成量达到28.0 g/L,PHB的平均释放率为46.1%；Ectoine的平均合成量达到1.8 g/L/循环,Ectoine的总合成量达到7.2 g/L,Ectoine的平均分泌率为75.8%,平均释放率为93.7%。发酵罐发酵,一个制备周期(4个循环)内,PHB总合成量达90.2 g/L,Ectoine总合成量达27.8 g/L,共合成效率达到0.95g/L/h。PHB和Ectoine提取率分别为87.9%和88.9%,使PHB/Ect共合成产物合成效率和提取回收率显著提高。本文利用具有低渗冲击耐受性的Ectoine分泌型菌株H. venusta DSM 4743进行的PHB/Ect共合成研究,为进一步提高PHB/Ect共合成效率提供了新的、有效的方法。为解决PHB工业化生产的瓶颈问题提供了依据,对于推动PHB和Ectoine的大规模工业化生产和应用具有一定意义。