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肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的恶性肿瘤之一，手术治疗复发率高，传统放、化疗对正常组织毒害大，本组建立的免疫促凋亡策略已经在HER2肿瘤模型中证实具有明确的抗肿瘤作用，该策略靶向性高、副作用小，有希望推广应用于HCC的抗肿瘤治疗。关键问题是首先获得能够特异地识别HCC肿瘤标志物的单链抗体，以此抗体构建免疫促凋亡分子，使之靶向杀伤HCC肿瘤细胞。本课题组曾从噬菌体抗体库筛选、改造获得一株对HBsAg具有亲和活性并可经由内吞体进入HBsAg阳性肿瘤细胞的人源性单链抗体（scFv15），并证实了由scFv15/鱼精蛋白构成的重组分子能够将小核酸类效应分子特异地输送到HBsAg阳性肝癌细胞中，发挥抗病毒效应，为将该单链抗体用于构建靶向HBsAg的免疫促凋亡分子提供了有力的实验依据。靶向HBsAg的免疫促凋亡分子由三部分组成：特异识别HBsAg的scFv15、转位结构域和促凋亡分子。免疫促凋亡分子由scFv15介导靶向进入HBsAg阳性肝癌细胞后，其抗肿瘤作用的强弱取决于两个要素。第一个要素是促凋亡分子必须经过优化，具有尽可能强的细胞凋亡诱导效应。本课题组曾筛选比较了caspase-3、caspase-6、granzyme B、AIF、tBid等多种人体自身促凋亡分子，体内外实验证实，tBid具有分子量小、渗透性强、诱导凋亡时效短、促凋亡效应强等优点，因此本研究采用tBid作为促凋亡效应分子。第二个要素是免疫促凋亡分子必须能够从内吞体转位进入胞浆，具有尽可能高的内吞体转位效率。这是因为免疫促凋亡分子内化进入肿瘤细胞后，包裹于内吞体中，必须从内吞体转位释放到胞浆，才能发挥杀伤效应。免疫促凋亡分子的转位过程包括两步：一是内吞体中的Furin蛋白酶切割免疫促凋亡分子，使单链抗体部分与促凋亡分子分离；二是内吞体膜被破坏，促凋亡分子释放到胞浆。我们以往的研究已经对转位的两步骤进行了优化：第一步的优化结果显示，白喉毒素的Furin识别序列（Fdt）的切割效率最高；第二步的优化结果显示，流感病毒血凝素蛋白中的HA2序列破坏内吞体膜的能力最强，但HA2序列在融合蛋白中所处的位置是否影响其转位功能尚不清楚。本研究首先观察了HA2序列的位置与转位功能的关系。将HA2序列分别融合于scFv15的N端和C端，只有HA2-scFv15能够破坏内吞体膜，使标记FITC的指示分子弥散性分布于胞浆，因此本研究选择将HA2融合于效应分子的N端。基于上述实验结果，本研究将scFv15、Fdt、HA2、tBid四部分融合表达，构建靶向HBsAg的免疫促凋亡分子scFv15-Fdt-HA2-tBid。该分子具有Fdt序列，可在内吞体中经Furin蛋白酶切割，将HA2暴露于多肽链N末端，进而破坏内吞体膜，释放tBid进入胞浆发挥杀伤效应。构建不含HA2序列的免疫促凋亡分子scFv15-Fdt-tBid作为对照。体外实验表明，scFv15-Fdt-tBid和scFv15-Fdt-HA2-tBid都具有良好的抗原靶向性，可以特异性结合HBsAg阳性肿瘤细胞；融合有HA2序列的scFv15-Fdt-HA2-tBid分子较scFv15-Fdt-tBid能更快速的突破内吞体限制，转位进入胞浆。scFv15-Fdt-tBid和scFv15-Fdt-HA2-tBid对HBsAg阴性细胞无明显毒性，但能通过诱导凋亡显著降低HBsAg阳性肿瘤细胞存活率，且scFv15-Fdt-HA2-tBid的作用更强。免疫促凋亡分子的促凋亡效应与线粒体凋亡通路的激活有关，伴随着线粒体膜电位降低，caspase-9和caspase-3的活化。体内实验表明，经尾静脉注入肝原位荷瘤裸鼠体内的免疫促凋亡分子，能够逐渐向肿瘤所在位置富集，对其他正常组织脏器的累积分布较少，证明免疫促凋亡分子具有良好的在体靶向性及组织渗透性。免疫促凋亡分子治疗后，瘤体增长速度均显著减缓；相对于scFv15-Fdt-tBid，scFv15-Fdt-HA2-tBid具有更强的肿瘤增殖抑制作用，能够更高效地诱导肿瘤细胞发生凋亡。以正常Balb/c小鼠对scFv15-Fdt-HA2-tBid进行在体安全性检测，10倍剂量仍未表现出对重要脏器的损伤作用，没有引起明显的炎症反应，提示scFv15-Fdt-HA2-tBid具有良好的体内应用安全性。综上所述，免疫促凋亡分子scFv15-Fdt-HA2-tBid在体内外均可以靶向结合HBsAg阳性肿瘤细胞，具有较强的特异性和良好的渗透性；HA2序列的引入可以促进凋亡效应分子向胞浆释放，显著提高诱导肿瘤细胞凋亡的效率；该分子安全性较好，并且对人体的潜在免疫原性低，对于HBV相关HCC的治疗具有重要的应用价值。