目的：　　构建人PPM1D基因的RNA干扰慢病毒载体，测定病毒滴度。检测结肠癌细胞RKO在基因沉默后的细胞生物学变化及差异性基因的表达情况，以探索PPM1D基因在结肠癌细胞恶性增殖中的作用及其机制。　　方法：　　检索针对PPM1D的siRNA序列，参考Sigma网站公布的资源，选取一条siRNA序列，同时参考文献挑选一条通用siRNA阴性对照序列;两端加上酶切位点，合成双链DNA oligo，成为含干扰序列的具对应粘性末端的shRNA表达框架。将shRNA表达框架插入pFH-L慢病毒骨架质粒载体中，转化大肠杆菌感受态细胞，阳性克隆行PCR鉴定，构建含有针对PPM1D的shRNA病毒骨架质粒。　　用shPPM1D或者对照组的短发卡RNA表达质粒转染239T细胞，同时也转染两个帮助质粒，分别是pCMVAR8.92和pVSVG-(I)，这两个质粒编码慢病毒组装蛋白。应用Lipofectamin2000(Invitrogen)转染后48小时，收集包含组装慢病毒的培养基，使用0.45μm的滤纸进行浓缩。病毒滴度确定和校准后，慢病毒溶液储存于-80℃。　　慢病毒感染，RKO细胞中加入组装的慢病毒，在37℃，5％CO2中培养至少3天。转染后收获RKO细胞，按照厂家说明书应用Trizol提取RNA。应用M-MLV逆转录酶(Promega)反转录成cDNA。 PPM1D的表达水平使用TB200应用荧光定量混合物性实时PCR进行评价。PPM1D的引物为PPM1D5-CTACACCACCAGTCAAGTCAC3前向）and5-AGAAGGCATTGCTACGAACC-3（反向）。PBS冲洗后，收集RKO细胞，使用RIPA缓冲液进行裂解。RIPA缓冲液的组成:20 mM Tris-HCl(pH7.5),150 mM NaCl,1 mM Na2EDTA,1 mM EGTA,1％ NP-40,1％脱氧胆酸钠，2.5 mM焦磷酸钠，1 mMβ甘油磷酸盐，1 mM Na3VO4，1μg/ml亮抑酶肽。SDS-PAGE分离蛋白标本，转移，与一抗4℃孵育过夜。室温下二抗孵育1小时后，使用增强化学发光(Amersham)进行观察。　　慢病毒感染后3天，RKO细胞悬液接种于96孔板，最初的浓度为每孔2000细胞。然后每孔加入20μl5 mg/ml的MTT。细胞孵育3小时后，每孔加入100μl的酸化异丙醇(0.01 M HCl)。甲瓒沉淀物溶解后，在595nm光波长度下应用酶标仪读板。　　慢病毒感染后3天，RKO细胞悬液接种于6孔板，最初的浓度为每孔1200细胞。当每个单克隆包含50个细胞以上时，捕获影像。然后，标本使用4％福尔马林固定并根据说明书进行Giemsa染色，并摄影。　　慢病毒感染后3天，收集RKO细胞，冷PBS重悬，然后4℃下用预冷的75％乙醇进行固定30分钟。PBS冲洗后，4℃下与含有RNA酶和碘化丙啶的PBS暗室孵育过夜。流式细胞仪分析标本，数据使用多周期AV软件进行分析。　　结果：　　GFP荧光证明，慢病毒的转染率很高，实验组和对照组类似。使用RT-PCR，我们测量了PPM1D的mRNA水平。我们发现转染了Lv-shPPM1D后，与未转染或者转染对照质粒者，其表达水平下降了60％左右。蛋白水平使用Western印迹法进行评价。我们发现Lv-shPPM1D可以显著降低内源性PPM1D的蛋白水平。　　为研究结直肠癌细胞中PPM1D沉默的效应，检测了增殖和群落形成能力。Lv-shPPM1D感染后，增殖率与非感染或对照组的增殖率下降了。然后分析了RKO细胞的群落形成能力。PPM1D沉默可以显著减少RKO细胞的群落形成能力。使用Giemsa染色，我们发现单个群落中细胞数目显著减少。上述证据提示内源性PPM1D的表达减少可以显著抑制结直肠癌的生长。　　为研究是否PPM1D敲除诱导细胞生长抑制是否是由于细胞周期的调节失调，行流式细胞仪检测。Lv-shPPM1D感染诱导RKO细胞集中在细胞周期的G0/G1期。在Lv-shPPM1D感染组，45.87±0.64％的RKO细胞在细胞周期的G0/G1期，这比非感染组(38.67±0.93％)和对照质粒转染组(42.60±0.95％)显著升高。在PPM1D沉默组，44.00％±0.17％的RKO细胞处于细胞周期的S期，这比非感染组(52.20±0.62％)和对照质粒转染组(48.50±1.25％)显著降低。我们进一步分析了处于亚G1期的细胞比例。PPM1D敲除后，5.98±0.35％的细胞处于细胞周期的亚G1期，这比非感染组(1.47±0.11％)和对照质粒转染组（1.70±0.08％）显著升高。这些结果提示敲除PPM1D后诱导细胞聚集于亚G1期，导致细胞增殖和群落形成受抑制。　　为进一步研究PPM1D沉默诱导肿瘤细胞生长抑制的机制，我们分析了细胞生长相关信号分子的表达水平。CyclinB1和CyclinD1是细胞周期控制中的调节性蛋白。我们发现敲除PPM1D导致CyclinB1的下调，而不影响CyclinD1的表达水平。由于细胞增殖中ERK信号传导系统发挥重要的作用，而PPM1D依赖于ERK活化，我们评价了PPM1D敲除后ERK的活化。我们发现结直肠癌细胞中抑制PPM1D的表达后，磷酸化的ERK减少了。而且，由于AKT磷酸化也与细胞增殖有关，我们检测了AKT通路的活化。我们发现Lv-shPPM1D敲除PPM1D后，磷酸化AKT的数目显著增加。上诉这些证据说明应用慢病毒介导的RNA沉默抑制PPM1D表达，可以通过抑制CyclinB1/ERK通路抑制结直肠癌的细胞增殖。　　结论：　　RNA干扰技术是广泛应用的是目标基因沉默的技术，它作用于mRNA水平，而且慢病毒可以使干扰RNA有效的传递到目标细胞。　　Lv-shPPM1D可以有效的减少内源性的PPM1D表达，从而抑制结直肠RKO细胞的细胞增殖和群落形成。PPM1D敲除可以导致细胞周期停滞在G0/G1相，细胞聚集在亚G1期，从而导致细胞生长抑制。　　PPM1D敲除可以诱导CyclinB1和磷酸化-ERK的下调，而不影响CyclinD1的表达。PPM1D敲除可以促进AKT磷酸化，提示PI3K/AKT通路活化。因此，CyclinB1，ERK和AKT可能是PPM1D的下游信号分子。 PPM1D敲除诱导的CyclinB1和磷酸化-ERK下调和AKT活化可能是RKO细胞细胞周期停滞和细胞增殖抑制的分子机制。