Brd2基因的探针制备及其在小鼠大脑皮层的形态学研究

来源 :宁夏医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jiaojiao82
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目的为了观察溴结构域包含蛋白2(Bromodomain containing protein2,Brd2)基因在小鼠大脑皮层的表达分布并系统了解其神经化学特点,本研究首先制备两条地高辛标记的Brd2cRNA反义探针。并且应用荧光原位杂交技术验证两条探针的检测效果,之后选用其中一条探针观察和分析Brd2mRNA在C57BL/6小鼠大脑皮层组织的表达与神经化学特点。方法本实验首先提取小鼠大脑皮层组织总RNA,设计两对Brd2引物,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,得到两个Brd2基因的目的DNA片段,并将其分别克隆到pCRⅡ-TOPO载体中,根据载体上T7和SP6启动子位点进行体外转录合成两条地高辛标记的cRNA反义探针,应用荧光原位杂交实验验证两条探针的特异性并观察其在脑组织切片中的杂交效果。本实验将12只健康成年C57BL/6小鼠随机分为两组,第一组小鼠灌注取材切片,应用荧光原位杂交实验检测Brd2基因在小鼠大脑皮层组织中的表达特点;第二组小鼠脑组织切片则采用荧光原位杂交结合免疫荧光双标染色的方法观察与分析小鼠大脑皮层组织中Brd2mRNA阳性细胞的神经化学特点。结果(1)本研究应用分子神经生物学技术成功构建了两个Brd2/pCRⅡ-TOPO质粒,通过体外转录实验获得了两条较高效价的地高辛标记的cRNA反义探针,在荧光原位杂交实验中应用两条探针显示出较好的杂交效果。(2)选择两条探针中的一条进行荧光原位杂交实验,观察和分析Brd2mRNA在C57BL/6小鼠大脑皮层组织中的表达情况。结果显示在小鼠大脑皮层组织中,Brd2mRNA存在不同强度的表达,而且主要表达于神经元所在的部位。(3)采用荧光原位杂交结合免疫荧光双重标记染色的方法观察Brd2mRNA阳性细胞与神经元核蛋白(NeuN),胶质纤维酸性蛋白(GFAP),γ-氨基丁酸(GABA),维生素D依赖性钙结合蛋白(CB),钙视网膜蛋白(CR)和小白蛋白(PV)在小鼠大脑皮层组织中的表达类型与共存情况。结果显示,C57BL/6小鼠大脑皮层组织中Brd2mRNA阳性细胞主要表达分布于NeuN阳性的神经元中,而GFAP阳性的星形胶质细胞几乎不表达Brd2mRNA。在小鼠大脑皮层组织中,Brd2mRNA与GABA、CB、CR和PV均有共存。其中Brd2/GABA共存细胞占Brd2mRNA阳性细胞的18%,占GABA阳性细胞的52%;Brd2/CB共存细胞占Brd2mRNA阳性细胞的23%,占CB阳性细胞的82%;Brd2/CR共存细胞占Brd2mRNA阳性细胞的20%,占CR阳性细胞的82%;Brd2/PV共存细胞占Brd2mRNA阳性细胞的13%,占PV阳性细胞的31%。结论(1)本实验制备的地高辛标记的cRNA反义探针可特异地检测Brd2mRNA在大脑皮层组织中的表达。(2)Brd2mRNA在C57BL/6小鼠大脑皮层组织中广泛表达,并且主要表达于神经元中,星形胶质细胞几乎不表达Brd2mRNA。(3)较系统地探讨了小鼠大脑皮层组织中Brd2mRNA阳性细胞的神经化学特点,阐明了Brd2基因与GABA、CB、CR和PV的共存情况,为深入研究小鼠大脑皮层组织中Brd2基因的功能提供了形态学实验依据。
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