当今,糖类已成为食品行业广泛、大量采用的风味添加剂,其缺失会严重影响食品风味。然而,大量摄入糖类后会引起血糖浓度升高,诱发龋齿、肥胖症和糖尿病等病症,严重影响人类健康。于是,寻找一类安全、有效的甜味剂就成为了人们日益关注的焦点。甜味蛋白的发现,为解决这一难题提供了新的线索。 甜味蛋白,即能引起甜味反应的蛋白质分子。自上世纪70年代以来,陆续从热带植物中发现了miraculin、monellin、mabinlin、thaumatin、curculin、brazzein和pentadin七种甜味蛋白分子,是一类很有应用前景的甜味添加剂。Brazzein是其中分子量最小、活性最稳定的一类物质。它是由54个氨基酸残基组成的单链多肽,分子量6.5KD,等电点5.0,甜度为同等摩尔浓度蔗糖的3500倍,同等质量蔗糖溶液的2000倍;且性质稳定,98℃加热2h或80℃加热4 h仍保持甜味。 由于甜味蛋白Brazzein原植株异地种植不能结果以及化学合成造价昂贵,产物甜度不一致等种种不利因素,只能采用基因工程的方法进行大规模生产。但是,原核表达系统表达的蛋白质往往缺乏生物活性,因为原核生物自身缺乏有效的蛋白质翻译后加工系统。故我们采用真核表达系统进行甜味蛋白Brazzein的表达。Pichia pastoris酵母和哺乳动物细胞是目前广泛采用的真核表达宿主细胞,它们能对表达的蛋白质进行有效的翻译后修饰,使产物尽可能接近天然蛋白的构象和活性。 本实验参照NCBI公布的甜味蛋白Brazzein成熟区氨基酸序列,结合Pichia pastoris酵母的偏爱密码子和Brazzein甜味机制相关研究,对其基因序列进行了改造,设计了3处氨基酸突变（Asp29 Lys、His31Ala、Glu41 Lys）,并通过SOE-PCR扩增合成了全长基因。 将鉴定正确的Brazzein基因与载体pGAPZaA连接,构建重组表达载体pGAPZaA-Bra,酶切线性化后电转至感受态Pichia pastoris酵母SMD1168,zeocin抗生素筛选出阳性菌株。25℃下培养72h,对培养物进行SDS-PAGE分析。结果表明,Brazzein在酵母中有效表达,以分泌表达形式存在于培养基上清中。用Ni+亲和层析介质进行纯化,得到了单一的蛋白质分子。接着利用凝血酶对纯化的蛋白质进行酶切处理,去掉C-端标签分子,并再次Ni+介质纯化,最后得到了纯的Brazzein蛋白。甜度测试显示,不含氨基酸突变的Brazzein蛋白甜度约为等质量蔗糖的100倍,而含突变氨基酸的Brazzein蛋白甜度有所提高,约为等质量蔗糖的150倍。对Brazzein表达条件进行优化,分别设置20℃、23℃、25℃、28℃、30℃5个温度梯度和12h、24h、48h、72h、96h5个时间梯度,结果表明,23℃培养72h时表达效率最高,约为9.2mg/L。 将Brazzein基因与载体pcDNA3.1连接,构建重组表达载体pcDNA-Bra,并通过脂质体2000转染至贴壁培养的COS-7细胞中。转染细胞培养48h后提取RNA并反转录成cDNA。以GAPDH作为参照基因,进行RT-PCR检测。结果显示,转染细胞中Brazzein基因mRNA丰度为7753个拷贝,约为GAPDH mRNA拷贝数的18倍。由于动物细胞蛋白表达效率相对较低,故未能得到纯的蛋白质产品。 综上所述,甜味蛋白Brazzein在Pichia pastoris酵母中得到了表达,但表达效率和产物活性距离大规模生产要求尚有较大差距,需要进行发酵罐水平的表达研究。由于时间关系,在动物细胞中的表达实验尚未直接获得蛋白质产物,仅为后期的大规模瞬时表达研究提供参考。