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1、研究背景及目的:结直肠癌是当今全球发病率排名3的恶性肿瘤,是一种常见的消化道癌症,具有高发病率,高死亡率的特点。近年来由于生活水平的提高,中国结直肠癌患者呈现年轻化,30岁以下患者约占10%~15%。且青年患者的预后较中老年患者的预后差,青年患者5年生存率仅为中老年患者的1/4。早期结直肠癌5年生存率可达90%以上,晚期5年生存率低于10%,目前临床确诊的患者70%以上为中晚期。手术加药物是治疗结直肠癌的主要手段。目前,临床常用抗结直肠癌的单抗类药物主要为:西妥昔单抗、贝伐珠单抗、帕尼单抗、雷莫芦单抗等;抗结直肠癌的化学药物主要为瑞格非尼、卡培他滨、奥沙利铂、氟尿嘧啶、伊立替康等。但是目前临床上使用的化疗药物不良反应高,易产生耐药性,治疗后易复发和转移。因此发现高效抗结直肠癌药物是非常必要的。课题组的前期发现,BOC26P对多种肿瘤细胞具有抑制增殖活性的影响,但前期未对BOC26P抗结直肠癌做进一步的研究,因此本论文将阐述BOC26P抗结直肠癌作用及其初步作用机制。2、实验方法:本实验主要从BOC26P在体内、外抗结直肠癌作用,BOC26P诱导结直肠癌细胞株SW480及HCT116发生凋亡,BOC26P抑制侵袭和转移,BOC26P抑制Wnt通路等方面进行:1)采用MTT的方法,考察BOC26P对结直肠癌细胞株SW480及HCT116增殖活性的影响。2)构建裸鼠HCT116皮下移植瘤,考察BOC26P在体内抗结直肠癌的作用。3)采用Annexin-V-FITC/PI凋亡试剂盒,考察BOC26P对结直肠癌细胞株SW480及HCT116凋亡的影响。4)采用划痕实验和Transwell迁移实验,考察BOC26P对结直肠癌细胞株SW480及HCT116迁移影响。5)采用Transwell侵袭实验,考察BOC26P对结直肠癌细胞株SW480及HCT116侵袭的影响。6)采用Western Blotting实验,考察BOC26P对人结直肠癌细胞株SW480及HCT116相关蛋白表达的影响。7)采用小管形成实验的方法,考察BOC26P对HUEVC在体外小管形成的影响。3、实验结果:1)细胞增殖活性抑制实验显示:BOC26P对HCT116及SW480作用48 h的IC50分别为0.218±0.103,0.425±0.142(μM)。2)HCT116裸鼠皮下移植瘤实验结果表明:在给药第12天后,BOC26P-10 mg/kg给药组、阳性对照组5-FU-10 mg/kg的T/C%值分别为40.27%,37.76%,在给药第14天后,BOC26P-10mg/kg给药组,阳性对照组5-FU-10mg/kg的T/C%值分别为39.86%,37.76%,在给药第16天后,BOC26P-10mg/kg给药组、阳性对照组5-FU-10mg/k的T/C%值分别为36.34%,32.43%。依据CFDA《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》(T/C%>40%为无效;T/C%≤40%,并经统计学处理P<0.05为有效),实验结果表明实验组BOC26P-10mg/kg能有效的抑制结直肠癌细胞株HCT116裸鼠皮下移植瘤的增殖。3)流式结果提示BOC26P诱导HCT116及SW480细胞发生凋亡。4)划痕实验结果表明,用0.2μM BOC26P处理SW480 48 h时,发现对照组的划痕宽度比给药组明显变小(P<0.05),采用0.1μM BOC26P处理HCT116 48 h时,发现对照组的划痕宽度比给药组明显变小(P<0.05),表明BOC26P具有良好的抑制SW480以及HCT116的迁移能力。Transwell迁移实验结果表明用0.2μM BOC26P处理SW480 24 h时,发现给药组穿过聚碳酸酯膜的细胞数目比对照组细胞数目少(P<0.05),采用0.1μM BOC26P处理HCT116 24h时,发现给药组穿过的细胞数目比对照组的细胞数目少(P<0.05),表明BOC26P具有良好的抑制SW480及HCT116的迁移能力。3.5 Transwell侵袭实验结果表明用0.2μM BOC26P处理SW480 48h时,发现给药组穿过聚碳酸酯膜的细胞数目比对照组细胞数目少(P<0.05),采用0.05μM BOC26P处理HCT116 48h时,发现给药组穿过的细胞数目比对照组的细胞数目少(P<0.05),表明BOC26P具有良好的抑制SW480及HCT116的侵袭能力。3.6 Western blot实验结果提示不同剂量的BOC26P(0.01、0.1、0.05、0.2、0.5μM)与HCT116及SW480孵育24h后,BOC26P Cleaved PARP、Cleaved Caspase 3也增加。同时BOC26P能够增加BAX的表达以及减少BCL-2的表达。表明BOC26P可能通过线粒体途径产生凋亡。在HCT116以及SW480细胞中,在BOC26P不同的浓度处理后,上皮表型标志物E-cadherin成浓度依耐性表达上调,间质型标志物Vimentin,Fibronectin成浓度依耐性表达下调。同时EMT相关转录因子Snail表达下调,MMP9表达下调。表明BOC26P能抑制细胞的侵袭。BOC26P HCT116细胞株在BOC26P给药浓度为0.2μM,给药时间为1、5、15、30、60 min,BOC26P能减少AKT的磷酸化,使得GSK-3β9位的磷酸化减少,从而使得β-catenin的磷酸化增加。SW480细胞株在BOC26P给药浓度为0.5μM,给药时间为1、5、15、30、60 min,BOC26P同样能减少AKT的磷酸化,使得GSK-3β9位的磷酸化减少,从而使得β-catenin的磷酸化增加。3.7 0.05μM BOC26P能抑制HUEVC细胞在体外血管环的形成。同时BOC26P浓度为0.01、0.05、0.1、0.2、0.5(μM)处理SW480以及HCT116细胞24h,进行Western Blot检测。实验结果表明BOC26P能够抑制SW480以及HCT116中VEGF的表达。进一步验证BOC26P能够抑制肿瘤细胞的血管形成。4、实验结论1)BOC26P对这两株结直肠癌细胞株的IC50值均在0.5μM以下,表明BOC26P对这两株结直肠癌细胞株具有良好的杀伤作用。且在体内BOC26P对HCT116裸鼠皮下移植瘤作用良好的生长抑制作用。2)BOC26P能诱导HCT116以及SW480发生凋亡。3)BOC26P能抑制HCT116以及SW480的迁移、侵袭、EMT转化及血管生成。4)BOC26P能抑制HCT116以及SW480细胞中的Wnt通路。