第一部分 SIRT1杂合子敲除(SIRT1+/-)小鼠的表型研究　　 [研究背景和目的]　　 随着经济的发展、人们生活方式的改变以及人口老龄化，糖尿病已成为威胁全球人类健康的世界性公共卫生问题。众所周知，遗传因素和环境因素在机体代谢调节、糖尿病的发生发展中均起着十分重要的作用。SIRT1(sirtuinl)是一种依赖于NAD+的去乙酰酶，作用于参与细胞调控的蛋白之上。本研究以C57BL/6为基因背景的SIRT1杂合子敲除(SIRT1+/-)小鼠为研究对象，进行正常饮食、高脂饮食和低脂饮食三种不同饮食的干预，并在此基础上对其进行表型的研究，借以研究遗传因素和环境因素在机体代谢调节中的不同作用。　　 [研究方法]　　 将129/J基因背景的SIRT1杂合子敲除(SIRT1+/-)小鼠与C57BL/6杂交5代后，建立C57BL/6为基因背景(97.5％以上)的SIRT1杂合子敲除(SIRT1+/-)小鼠。以SIRT1+/-小鼠内部杂交后产生的雄性SIRT1+/-小鼠及同窝的野生型(Wild-type)正常对照小鼠作为研究对象，检测指标如下：　　 (1)分别用正常饮食(MFD，11％fat w/w)、高脂饮食(HFD，36％fat w/w)、低脂饮食(LFD，5％fat w/w)进行饮食干预，每2-4周/次的体脂(通过NMR仪测定)、血糖测定，Metabolic Chamber检测能量消耗、耗氧量、呼吸交换率、自发活动及进食量，研究其代谢状态；　　 (2)基础状态及饮食干预后小鼠血浆的胰岛素水平；饮食干预12周后进行腹腔糖耐量、胰岛素耐量试验；　　 (3)生化指标(基础状态及饮食干预后)：血浆甘油三酯、总胆固醇的水平，血清谷丙转氨酶(ALT)水平；　　 (4)肝脏和脂肪组织的收取及称重：在正常饮食及高脂饮食喂养后，收取小鼠肝脏及脂肪组织(附睾旁脂肪，腹膜后脂肪，皮下脂肪)并称重；　　 (5)肝脏组织形态学检查：肝脏外观、重量，H&E染色。　　 [研究结果]　　 (1)在正常饮食和高脂饮食喂养下，SIRT1+/-小鼠相对野生型对照组均出现以下改变，且高脂饮食时更为显著：体脂含量增加、能量代谢水平降低、空腹血糖增高、胰岛素抵抗、肝脏脂肪变性(H&E染色，肝转氨酶ALT水平升高)，但在进食量、体内骨骼肌组织重量、消化道对脂肪的吸收等方面无明显差异；SIRT1+/-小鼠体脂的增多主要分布在肝脏及皮下，而附睾旁脂肪，腹膜后脂肪等脂肪组织相对野生型对照没有明显变化；血浆甘油三酯水平在SIRT1+/-小鼠中降低，且在高脂饮食下有统计学差异；血浆总胆固醇和游离脂肪酸水平无统计学差异；　　 (2)在低脂饮食喂养下，SIRT1+/-小鼠相对野生型对照组在体重、体脂含量及能量代谢等方面无明显异常，且无肝脏脂肪变性的表型。　　 [结论]　　 (1)正常饮食喂养即可导致SIRT1+/-小鼠能量代谢水平降低、胰岛素抵抗及肝脏脂肪变性。SIRT1活性的缺失可显著增加SIRT1+/-小鼠因饮食中脂肪含量增高所致肝脏脂肪变性的风险。　　 (2)在饮食中脂肪含量增高的情况下，SIRT1+/-小鼠存在脂肪异位沉积在肝脏的情况；血浆甘油三酯水平在SIRT1+/-小鼠中降低，提示SIRT1+/-小鼠肝脏中甘油三酯的输出功能可能受损。　　 第二部分 SIRT1活性缺失导致SIRT1+/-小鼠肝脏脂肪变性的机制研究　　 [研究背景和目的]　　 SIRT1可能参与控制游离脂肪酸的代谢过程，而其具体机制仍需要探索和建立。在本部分研究中，我们拟通过研究SIRT1+/-小鼠的代谢表型探讨SIRT1活性缺失导致SIRT1+/-小鼠肝脏脂肪变性的可能机制。文献报道SIRT1调节肝脏脂肪酸代谢主要通过两个途径：一是抑制脂肪合成和沉积，二是刺激脂肪酸氧化。前期结果表明SIRT1+/-小鼠脂肪肝与饮食中脂肪含量有关：在饮食中脂肪含量增高的情况下，SIRT1+/-小鼠存在脂肪异位沉积在肝脏的情况；接下来我们将进一步研究其具体机制。　　 此外，文献报道SIRT1在脂肪细胞中可以通过抑制PPARγ的活性从而抑制脂肪沉积、促进脂肪动员，该SIRT1+/-小鼠是否存在脂肪生长和分化的异常?SIRT1+/-小鼠出生时是否已经存在肝脏脂肪变性或相关基因表达的异常?　　 以上将是该部分研究的目的和重点。　　 [研究方法]　　 以SIRT1+/-小鼠内部杂交后产生的雄性SIRT1+/-小鼠及同窝的野生型(Wild-type)正常对照小鼠作为研究对象，进行以下研究：　　 (1)分别用正常饮食、高脂饮食、低脂饮食干预后，检测指标如下：肝脏/体重比值，肝脏总胆固醇、甘油三酯及甘油的水平；血中游离脂肪酸的水平；　　 (2)检测肝脏游离脂肪酸的氧化水平，评价SIRT1+/-小鼠肝脏脂肪酸氧化功能；　　 (3)肝脏中脂肪代谢和炎症相关基因的表达(mRNA水平)：如糖代谢及脂肪合成相关的基因G6pase、PEPCK、PPARγ、SREBP-1c、FAS、aP2、HSL、LPL、CD36、SCD1等，脂肪酸氧化相关的基因如PGC1α、UCP-2、CPT1α、CytoC、MCAD等，炎症相关基因如F4/80、TNF-α、IL-1b、IL-6、MCP-1等的表达水平，肝脏脂肪输出相关基因的表达如Apob、Apobecl、Apoe、Dgatl、Mttp；　　 (4)肝脏中脂合成代谢相关蛋白的表达(Western blotting)：如PPARγ(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)、SREBP-1c(控制脂肪酸合成的转录因子胆固醇调节元件结合蛋白-1c)等的表达；　　 (5)研究SIRT1+/-小鼠是否存在脂肪组织生长发育和分化的异常：脂肪组织(附睾旁脂肪)的组织形态学检查(如H&E染色)；检测脂肪组织中脂肪合成相关基因，脂肪因子、炎症因子的基因表达及血管生成相关基因的表达；SIRT1+/-小鼠胚胎成纤维细胞的脂肪分化能力；　　 (6)检测新生的SIRT1+/-小鼠肝脏、骨骼肌以及棕色脂肪组织中相关基因的表达，从而研究出生时SIRT1+/-小鼠是否已经存在异常。　　 [研究结果]　　 (1)在新生SIRT1+/-小鼠中，骨骼肌以及棕色脂肪组织中脂肪酸氧化及线粒体功能相关基因的表达无异常，肝脏脂肪合成、脂肪酸氧化及炎症相关基因的表达无显著差异；　　 (2)在低脂饮食喂养下，SIRT1+/-小鼠与野生型对照组相比不存在脂肪肝，在肝脏颜色、重量、肝脏脂质含量、脂代谢和炎症相关基因表达、蛋白表达上无明显差异；　　 (3)在正常饮食喂养下，SIRT1+/-小鼠相对野生型对照组出现脂肪肝(肝脏重量/体重比值增加、肝脏脂质含量增高)，脂肪合成相关基因和炎症相关基因的表达升高，肝脏脂肪酸氧化相关基因的表达无明显变化，游离脂肪酸的氧化水平无显著差异；脂合成代谢相关蛋白PPARγ、SREBP-1的表达水平升高；　　 (4)在高脂饮食喂养下，SIRT1+/-小鼠相对野生型对照组脂肪肝更显著，脂肪合成相关基因和炎症相关基因的表达升高更明显，肝脏脂肪酸氧化相关基因的表达仍无明显差异，肝脏脂肪输出相关基因Apob的表达下调；　　 (5)脂肪组织H&E染色显示SIRT1+/-小鼠附睾旁脂肪组织中细胞大小、密度及细胞外基质没有明显改变；脂肪合成相关基因、脂肪因子的基因表达没有显著差异；炎症及血管生成相关基因的表达升高；此外，体外实验表明，SIRT1+/-小鼠胚胎成纤维细胞诱导分化成为脂肪细胞的能力比野生型对照小鼠的增强。　　 [结论]　　 (1)出生时，脂肪酸氧化及线粒体功能相关基因和炎症相关基因在SIRT1+/-小鼠肝脏、骨骼肌以及棕色脂肪组织中的表达无显著差异，说明出生时SIRT1+/-小鼠不存在异常。　　 (2) SIRT1+/-小鼠因饮食中脂肪含量增高导致脂肪肝的风险显著增加，主要是由于SIRT1的活性缺失促进了SIRT1+/-小鼠肝脏的脂质合成，肝脏中脂肪酸的氧化并没有减弱。　　 (3) SIRT1+/-小鼠脂肪异位沉积在肝脏，可能同时与脂肪组织中的炎症增强有关。　　 (4) SIRT1+/-小鼠肝脏脂肪输出相关基因Apob的表达下调，结合之前的结果血浆甘油三酯水平在SIRT1+/-小鼠中降低，提示SIRT1+/-小鼠肝脏对甘油三酯的输出功能受损。