猪链球菌2型(SS2)是一种重要的人兽共患致病菌,可引起仔猪的脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎、肺炎以及断奶仔猪的猝死,并可感染人。在已知的33个血清型中,血清2型的致病力最强,流行范围最广。1998年和2005年,我国江苏和四川分别发生了人感染猪链球菌2型的公共卫生事件。细菌的粘附、侵袭和抗吞噬功能在致病过程中起着关键作用。SS2的致病性与其对支气管上皮细胞和血管内皮细胞的粘附和侵袭以及抗吞噬作用有关。已知的pgdA可通过参与细胞壁的合成而抵抗吞噬细胞杀灭,使SS2的毒力下降：SrtA递呈具备LPXTG基序的基因到细胞表面,从而介导细菌的粘附能力。但SS2确切的致病机制尚未阐明。我们通过生物信息学和比较功能基因组学,发现SS2可能参与介导细胞粘附的基因-分选酶、糖代谢调控的基因-CcpA(?)抗氧化应激的基因-SodA,目前国内外未见系统报道。在通过这些基因的插入失活和基因互补后,证明了其相关功能和作用。1、猪链球菌2型的基因型与毒力研究：对2006-2010年在浙江省屠宰场和猪场分离获得的42株猪链球菌2型菌株进行毒力基因分析,证明了其基因型主要为GDH+MRP+EF+CPS+SLY+,占全部分离株的93%。只有2株细菌为89kb+。根据猪链球菌MLST结果显示,上述猪链球菌2型分离菌株分别属于ST1和ST27复合群。菌毛分型分为3个基因型,A、B和N型。A型对应ST1复合群,B型对应ST27复合群。还发现了一种新的菌毛型,N型。A型和N型的粘附、抗吞噬能力和对小鼠的毒力要明显高于B型(P<0.05)2、分选酶与致病性：分选酶是革兰氏阳性细菌中普遍存在的一类酶蛋白,主要功能是能把细菌内含有LPXTG基序的蛋白递呈到细菌表面,后者与细胞相互作用,从而引起宿主致病。通过分析SS2的全基因序列,发现存在5种不同的分选酶基因,分别为(SrtA.SrtBCD.SrtE.SrtF和SrtG)。敲除这些基因后,SrtA、 SrtE和SrtG缺失菌株对细胞的粘附、侵袭和跨细胞能力显著降低(P<0.05)。在小鼠致病性试验中,SrtA、SrtE和SrtG缺失菌株比亲本菌株具有显著性差异,缺失菌株的致死率分别为20%,30%和30%,而二个不同的亲本菌株为90%和80%。SrtBCD和SrtF缺失菌株对细胞粘附、侵袭和在小鼠毒力试验的结果与亲本株相似(P>0.05)。试验结果证明了SrtA、SrtE和SrtG基因参与了SS2对于细胞粘附、侵袭和跨细胞作用,同时也影响细菌致病性。3、CcpA的代谢与致病性：CcpA是革兰氏阳性细菌一个重要的碳抑制性代谢基因。通过同源重组敲除该基因后,在糖代谢试验中,通过加入抑制性糖-葡萄糖或蔗糖,同时分别与纤维二糖,棉籽糖和甘露糖组成双糖培养基,突变菌株比野生菌株能更显著的提高分解棉籽糖和纤维二糖的酶蛋白合成,突变株的酶活性浓度通过OD400表示分别为1.22和0.78,亲本株的酶活性浓度明显被抑制,OD400只有0.2和0.25(P<0.01)。互补菌株酶蛋白合成能力与亲本株相似。荧光定量PCR证明突变菌株能下调sly,eno和cps2a毒力相关基因的转录,它们与亲本株的比例分别为34%、19%和34%(P<0.05)。细胞试验中证明CcpA基因缺失菌株能显著引起粘附和侵袭能力下降,分别0.38%和11%,而亲本菌株为0.62%和19%(P<0.05)。在小鼠致死率上,突变菌株为20%,而亲本菌株在三天后全部死亡,死亡率为100%。互补菌株在上述试验中的功能得到恢复。由此证明在SS2中CcpA基因不但调控碳的代谢还对毒力有重要的调控作用。4、SodA基因与致病性：细菌中SodA的主要作用是能催化在吞噬细胞中由呼吸爆发所释放的超氧化离子。通过研究SS2的全基因组发现SSU1356序列编码201个氨基酸的SodA基因。通过构建SodA突变菌株,发现在非变性胶中,突变菌株丧失SodA的活性。体外试验证明：在细菌与H2O2或百草枯共培养8个小时后,SodA突变菌株比野生菌株更容易被它们所引起的氧化反应所抑制,细菌浓度通过OD600表示,分别为0.13和0.11,而亲本株的生长明显浑浊,OD600为0.45和0.48。在细胞试验中,吞噬细胞系RAW264.7更容易杀灭SodA缺失株,在1.5小时内,细菌率为存活率28%,而亲本株的存活率为52%(P<0.05)。在小鼠实验中,器官中细菌计数的方法证明SodA缺失菌株更容易被体内的免疫系统杀灭,体内竞争试验(CI)结果证明：野生株/突变株的CI值分别为：血=0.0028、脑=0.0011、肾=0.001、肝=0.0013、脾=0.0012,其数值远远低于野生株/互补株的CI值(0.25-0.4)(P<0.01)。小鼠死亡率的比较中,突变菌株的致死率显著的低于野生菌株,分别为20%和100%。在构建SodA互补菌株后,其相关功能得到恢复。5、SS2菌毛蛋白分析和保护力研究：菌毛作为细菌重要的附属结构,在细菌的粘附和侵袭方面起着关键作用,被认为是亚单位疫苗的候选蛋白。分析猪链球菌2型的全基因组后,存在一个SrtG cluster的菌毛基因簇,具备二个与菌毛蛋白类似的基因,分别为Sgpl和Sgp2。克隆,表达这两个蛋白后制备其抗体,该抗体与SS2通过ELISA、WB和免疫胶体金电镜试验后可以确定这2个基因是编码细胞表面类似的菌毛样蛋白。在免疫保护实验中,以整个蛋白(Sgpl+Sgp2)进行免疫,其保护力可以达到80%,而PBS对照组的存活率为20%。由此推断SrtG菌毛簇的Sgpl和Sgp2可以作为亚单位疫苗的候选蛋白。本研究证实浙江地区的SS2分离菌株以菌毛A和B型为主,其中A型的毒力要显著强于B型；SrtA、SrtE和SrtG基因的缺失可通过降低粘附、侵袭与跨细胞力而使细菌毒力的下降。CcpA基因既可以调控糖代谢,也可以下调部分毒力相关基因表达,从而降低SS2对小鼠的致病力。SodA可能通过拮抗吞噬细胞呼吸爆发产生的超氧离子,提高SS2在吞噬细菌内的存活率,与其致病性相关。上述研究结果为深入探索猪链球菌2型的致病机制奠定了基础。