研究背景鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我国南方及东南亚各国常见肿瘤,其发病率男性高达27.49/万,女性达10.51/万。即使在我国北方地区,鼻咽癌也属于头颈部恶性肿瘤之首, 严重威胁人民健康和生命。鼻咽癌的治疗主要以放射治疗为主。随着放疗设备及技术的发展和临床经验的积累,Ⅰ、Ⅱ期患者5年生存率分别达92%、80%,但晚期(Ⅲ、Ⅳ)鼻咽癌的5年生存率仍徘徊在10%～40%左右, 治疗效果未从根本上得到改善。近年来较多研究发现,肿瘤中一小群具有自我更新能力,并可以产生分化的细胞构成肿瘤的主体细胞群。这一小群称为肿瘤干细胞(Cancer stem cell, CSC),可形成不同分化程度肿瘤细胞和无限增长,它们较非肿瘤干细胞具有更强的化疗和放疗抗性,是复发及转移的根源。肿瘤干细胞已经从白血病、乳腺癌、中枢神经系统肿瘤等多种肿瘤中成功分离和鉴定。鼻咽癌干细胞已有相当研究,Zhang等利用Brdu标记慢周期细胞证实鼠鼻咽部膜基底部有散在标记滞留细胞,证实鼻咽上皮存在少量慢周期细胞,随后发现裸鼠鼻咽癌移植瘤中同样存在一小群BrdU标记的慢周期细胞鼻咽癌细胞,提示鼻咽癌可能存在鼻咽癌干细胞(CSC). Wang等利用Hoechst33342染料在鼻咽癌细胞株CNE2中分离出类似干细胞的侧群细胞,且认为CK19是鼻咽癌干细胞标志物。2013年中山大学证实表面分子CD133可作为鼻咽癌干细胞的特异性分子,同年南方医科大学肿瘤研究所也通过分离鉴定ALDH1+亚群,证实ALDH1可以作为鼻咽癌干细胞的特异性标记物分离鉴定。因此CD133、ALDH1+以及使用荧光染料Hoechst 33342可作为鼻咽癌干细胞的候选标志物。然而,鼻咽癌干细胞的调控机制的还有待阐明。一氧化氮(nitric oxide, NO)是氮的化合物,作为血管内皮活性因子和一种信号传递分子,具有广泛的生理病理作用,其在呼吸、循环、免疫、神经等全身多系统的生理,病理生理及有关临床疾病中起着重要作用。由于其独特的生物学活性及不稳定性,使得NO的研究主要集中在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)上。一氧化氮合成酶(NOS)是催化NO生物合成的酶,专一催化L一精氨酸转化为L一瓜氨酸和NO,由于NO半衰期短,所以体内NO的生物作用完全依赖于NOS。NOS在体内广泛分布,其同工酶有三种亚型,即神经型一氧化氮合酶(nNOS or NOS1)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS or NOS2)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS or NOS3)。eNOS存在于内皮细胞,心肌细胞和海马细胞；nNOS主要表达于神经元、骨骼肌和肺上皮细胞等；而iNOS在受到一些细胞因子的诱导而激活,如干扰素、肿瘤坏死因子、脂多糖、白介素-1以及炎症因子。nNOS和eNOS合称为结构型一氧化氮合酶(constitutive nitric oxide synthase, cNOS),在生理状态下产生低浓度和中等浓度水平的NO；NOS2主要由巨噬细胞产生并能够产生高浓度的NO。研究表明,NO的作用与其浓度相关,低浓度下发挥往往促进细胞增殖和抗凋亡作用,而高浓度时不利于细胞生长而诱导细胞凋亡。在人和动物的多种实体肿瘤中NOS表达增强。胃肠道肿瘤、乳腺癌、膀胧癌以及头颈部肿瘤和鼻咽癌均发现NOS高表达,而且NOS表达与肿瘤复发和转移相关。NOS产物NO作为细胞间信号传递的重要调节因子,具有多重促肿瘤的作用。NO不仅调节p53的构象使之失活,导致其监控、修复损伤和突变后DNA的能力丧失,促进细胞的转化,从而诱导肿瘤形成。肿瘤微环境中的细胞因子和化学因子可为巨噬细胞维持低水平的NO和活性提供适当的信号,促进肿瘤发展,如促进肿瘤血管生成,调节血流量而促进肿瘤的生长和转移；NO还影响肿瘤细胞的代谢, 促进肿瘤细胞的凋亡以及参与抗肿瘤药物抗肿瘤的过程。近来的研究表明,NO具有促干细胞作用。正常胚胎干细胞补充外源性NO,可抑制干细胞因缺乏干细胞生长因子LIF的支持导致的分化作用。肿瘤细胞中的NO促进促进小鼠脑肿瘤干细胞的自我更新通路,增强肿瘤细胞在免疫缺陷鼠体内形成肿瘤的能力和增长速度。人的脑胶质瘤干细胞中NOS2的表达量较正常神经干细胞高,并促进脑胶质瘤干细胞自我更新,体内肿瘤生长和成瘤。鼻咽癌高表达NOS2,并促进鼻咽癌转移,与鼻咽癌预后呈负相关,提示内源性NO可能参与鼻咽癌的发生发展。然而鼻咽癌中NOS表达是否调控鼻咽癌干细胞功能还未见报道。本课题拟探讨鼻咽癌中NOS的表达与鼻咽癌干细胞的关系,以及NOS是否调控鼻咽癌干细胞功能,同时探讨其可能的机制。从而为阐明鼻咽癌肿瘤干细胞的机制提供基础及对其治疗提供一个新的思路。内容与方法：一、 鼻咽癌中NOS表达(一)鼻咽癌细胞株恶性表型、干细胞比例与NOS表达的相关性1.NOS表达与鼻咽癌细胞株恶性表型(侵袭与成瘤)的相关性以六株鼻咽癌细胞株为实验对象,通过生长曲线、Transwel1、平板克隆以及肿瘤成球培养l(tumor sphere formation)等实验,对鼻咽癌细胞株的侵袭和成瘤功能进行评估,分析鼻咽癌细胞株恶性表型的差异性；利用免疫荧光,荧光RealTime-PCR, Western Blot等方法检测六株鼻咽癌细胞株的NOS表达水平；统计分析六株鼻咽癌细胞株NOS表达与鼻咽癌恶性表型的相关性；2.NOS表达与鼻咽癌细胞株CSC比例的关系利用CD133、ALDEFLOUR ASSAY及SP等三种已经证实可作为鼻咽癌干细胞标记和分离的方法来检测六株鼻咽癌细胞株中鼻咽癌CSC比例；分析鼻咽癌细胞株NOS表达与鼻咽癌CSC比例的相关性；3.比较CSC与rlon-CSC、NOS表达水平的差异利用NOS1、NOS2单克隆抗体和荧光二抗,并共标记CD133, ALDH1干细胞标志物,通过流式细胞技术,检测CD133+亚群与CD133-亚群,ALDH+亚群与ALDH-亚群中NOS1和NOS2的表达,通过统计学分析NOS在它们的表达差异性；流式分选SP细胞与non SP,通过Western Blot检测两者表达NOS1及NOS2的表达。(二)NOS表达与鼻咽癌的临床相关性收集广东省粤西地区人民医院2003年1月～2005年5月期间80例鼻咽癌石蜡组织标本以及22例慢性鼻咽炎上皮组织标本。所有鼻咽癌患者活检前均未经任何放化治疗。应用免疫组织化学S-P法,检测NOS1、NOS2和NOS3的表达水平,统计分析NOS表达与鼻咽癌临床分级和干细胞转录因子的关系,从而明确鼻咽癌NOS表达与鼻咽癌发生发展的关系；二、 NOS表达对鼻咽癌CSC功能的调控作用(一)NOS抑制剂L-NAM ME对鼻咽癌CSC的调控作用1.L-NAME对鼻咽癌CSC比例的调控L-NAME作用于鼻咽癌细胞CNE2后,检测其SP细胞比例的变化,探讨NOS抑制对鼻咽癌CSC比例的调控作用；2. L-NAME对鼻咽癌成球功能(tumor sphere formation)的调控利用体外肿瘤细胞成球功能实验,比较鼻咽癌细胞株L-NAME组与对照组,成球能力的差异,分析L-NAME成球能力的调控作用；3.NOS抑制对鼻咽癌成球细胞的杀伤作用鼻咽癌细胞株成球培养后,用L-NAME进行杀伤实验,比较L-NAME处理组与对照组间肿瘤球的大小,分析NOS对鼻咽癌肿瘤球生长的调控作用；4.分析L-NAME对鼻咽癌干细胞转录因子的调控利用Western blot技术,检测鼻咽癌L-NAME组和对照组中肿瘤干细胞转录因子NANOG, SOX2 和 c-MYC等的表达,探讨L-NAME对肿瘤干细胞因子表达的调控作用；5.分析NOS1, NOS2以及NOS3分别对鼻咽癌CSC的作用NOS1、NOS2的特异性抑制剂(NPLAffl 1400w)以及L-NAME作用于鼻咽癌细胞株后,鼻咽癌CSC比例以及成球功能变化,探讨NOS1和NOS2对鼻咽癌CSC的作用。(二)NOS1沉默对鼻咽癌CSC功能的调控1.建立NOS1沉默以及对照的鼻咽癌细胞株利用shRNA技术和慢病毒载体,对鼻咽癌细胞株CNE2进行NOS1沉默,并筛选稳转细胞株(sh-NOS1-CNE2),同时转染无关序列建立对照细胞株(con-NOS1-CNE2)。并对两细胞株的增殖能力、细胞周期以及迁移功能进行检测,分析NOS1沉默对鼻咽癌细胞的生物学功能影响2.分析sh-NOS1-CNE2细胞株的CSC比例和成球功能改变,进一步证实NOS对鼻咽癌CSC功能的调控作用。(三)L-NAME对鼻咽癌裸鼠移植瘤的抑制作用1. L-NAME对鼻咽癌移植瘤生长的作用建立鼻咽癌细胞株CNE2的裸鼠移植瘤模型,待肿瘤长至1cm直径大小,小鼠腹腔注射L-NAME(实验组),对照组注射PBS。比较L-NAME组与PBS组间移植瘤体积与重量的差异,探讨NOS抑制对移植瘤生长的抑制作用；2. L-NAME对鼻咽癌移植瘤中CSC比例的影响取L-NAME组与PBS组的裸鼠移植瘤样本,制作单细胞悬液,流式技术分析其CSC比例,在裸鼠体内水平验证L-NAME对鼻咽癌CSC调控作用；3. L-NAME对鼻咽癌移植瘤中干细胞因子表达的调控Western blot检测L-NAME组与PBS组的裸鼠移植瘤样本中干细胞因子(NANOG,SOX2和c-MYC)改变,裸鼠体内实验验证L-NAME对肿瘤干细胞因子表达的调控作用；三、NOS调控鼻咽癌干细胞的机制(一)全基因组表达谱芯片技术分析1.鼻咽癌细胞株中NOS调控的干细胞功能相关基因选相对高成瘤能力的三株鼻咽癌细胞株,L-NAME处理72小时。将三株细胞株的L-NAME组和常规培养的两组进行全基因组表达谱检测(affimatrix芯片)。将实验组与对照组进行ANOVA比较分析,筛选NOS调控的差异基因。并利用网上生物信息学软件筛选其中干细胞相关的基因,获得NOS调控的干细胞的相关基因(NOS-CSC-gene)2.NOS调控的干细胞相关基因涉及的主要通路利用DIVAD软件,分析NOS-CSC-gene中涉及的通路；并从中分析NOS调控鼻咽癌干细胞基因涉及的主要通路。3.NOS调控的干细胞基因构成的分子网络利用string软件,分析NOS-CSC-gene构成的分子相关性网络,并结合NOS-CSC-gene涉及的主要干细胞通路,分析NOS调控的分子靶点；(二)分子生物实验验证1.鼻咽癌细胞株中验证NOS调控鼻咽癌干细胞的通路L-NAME抑制的鼻咽癌细胞株(L-NAME组)和其对照细胞(PBS组),提取总蛋白,western blotting检测其中生物信息学分析的NOS调控通路中的关键分子,验证生物信息学结果；2.鼻咽癌裸鼠移植瘤验证NOS调控鼻咽癌干细胞的通路L-NAME抑制的(L-NAME组)和其对照组(PBS组)鼻咽癌裸鼠移植瘤,进行western blotting和免疫组化分析,验证生物信息学结果,进一步明确NOS调控鼻咽癌干细胞的分子机制；结果：一、鼻咽癌细胞株NOS表达水平与鼻咽癌恶性表型和CSC比例呈正相关荧光定量-PCR和western blot检测结果显示：鼻咽癌六株细胞株均表达NOS1和NOS2,而且NOS2表达量相对较高,但NOS3的表达量很低,westernblot未检测；免疫荧光显示,NOS1和NOS2主要表现为细胞浆表达,部分细胞核表达。而NOS3仅微量胞浆表达；通过对六株鼻咽癌细胞株的侵袭、增殖以及CSC比例的检测,分析鼻咽癌细胞株恶性表型(侵袭、成瘤功能)和CSC比例,与鼻咽癌NOS表达的相关性,结果发现六株细胞株中,NOS1和NOS2的表达量与细胞的转移和成瘤功能,以及CSC比例呈正相关,高转移功能的5-8F和高成瘤功能的CNE2的NOS1和NOS2的表达量显著高于其它四株细胞(p<0.05)。二、鼻咽癌组织中表达NO S1和NOS2,其中NOS2表达水平与鼻咽癌临床分级关系密切免疫组化结果表明,80例鼻咽癌组织中,36例NOS1呈低表达,而44例呈高表达,表达部位位于癌细胞胞浆,阳性表达率为55.0%。80例鼻咽癌组织中,21例NOS2呈低表达,而59例呈高表达,阳性表达率为73.7%。表达部位主要位于癌细胞胞浆和/或胞核。NOS1和NOS2蛋白表达与鼻咽癌临床病理因素之间的联系：在鼻咽癌组织中,NOS2表达升高与肿瘤浸润(P=0.044)及临床分期进展(P=0.016)密切关联。χ2检验结果显示,NOS2与CSC相关标志物OCT4和Nanog有着密切联系,提示其表达可能与鼻咽癌细胞干性有关。而NOSl表达与患者性别、年龄、组织学类型、TNM分期等无明显关系,与也CSC无明显统计学意义。三、L-NAME降低鼻咽癌细胞株CSC功能L-NAME降低鼻咽癌细胞的CSC比例,其抑制作用呈剂量依赖关系；L-NAME还抑制鼻咽癌细胞成球功能,对鼻咽癌细胞球具有杀伤作用,而且L-NAME杀伤CSC球的浓度对常规培养的鼻咽癌细胞仅生长抑制作用而未见凋亡和坏死现象,推测L-NAME特异性杀伤鼻咽癌CSC。单独应用NOS1或NOS2特异性抑制剂(NPLA或1400w),对鼻咽癌干细胞无抑制作用,提示NOS1和NOS2可能共同参与鼻咽癌CSC功能的调控。sh-NOS1-CNE2细胞株的增殖、迁移能力、克隆形成率及CSC比例均明显降低,从而在基因水平证明NOS参与了鼻咽癌干细胞功能的调控。Western blot实验显示,L-NAME处理的鼻咽癌细胞株或sh-NOS1-CNE2中CSC因子NANOG、c-MYC的表达均下调,从分子水平证明NOS调控鼻咽癌干细胞功能。四、L-NAME移植鼻咽癌裸鼠移植瘤的生长CNE2裸鼠移植瘤模型显示：L-NAME抑制CNE2移植瘤生长,实验组的移植瘤重量和直径均显著小于对照组(P<0.05)。western blot和免疫组化均显示：L-NAME治疗处理的移植瘤中Nanog和 c-myc的表达水平显著低于对照组,提示L-NAME通过抑制鼻咽癌干细胞功能而发挥抑制肿瘤作用。五、NOS通过PI3K/AKT通路调控鼻咽癌CSC通过比较鼻咽癌细胞株(SUME1/5-8F/CNE2)的L-NAME处理组与其对照组的全基因组芯片,我们筛选1700余差异表达的基因(ANOVA,P<0.05),并将这些基因通过geneclin软件在线分析,筛选出干细胞相关基因122个。这些基因主要参与细胞发育和分化功能。DIVID软件分析显示,这些基因涉及的信号通路为生长因子GF/生长因子受体GFR/RAS/PI3K/AKT/干细胞转录因子。String软件分析显示,这些基因构成的分子网络形成的结点以RAS和AKT为中心,支持DIVID软件分析结果。为验证生物信息学分析结果,我们对鼻咽癌细胞株L-NAME处理组与其对照组中AKT磷酸化蛋白和PTEN蛋白进行western blot检测,结果显示L-NAME抑制鼻咽癌细胞中AKT磷酸化蛋白,而对AKT磷酸化抑制蛋白PTEN上调。从而证明NOS通过AKT通路调控鼻咽癌CSC功能。结论：1.鼻咽癌细胞株NOS表达与其恶性表型(侵袭和成瘤功能)以及CSC比例与NOS表达水平呈正相关系,而L-NAME抑制的鼻咽癌细胞株CNE2和sh-NOS1-CNE2中CSC比例、成球能力均发生抑制,证明了鼻咽癌中NOS促进CSC功能而增强鼻咽癌的恶性表型；2.鼻咽癌组织和细胞株中NOS表达与磷酸化AKT以及其下游的干细胞转录因子(NANOG和c-myc)呈正相关,提示鼻咽癌NOS通过P I3K/AKT通路调控癌干细胞功能；3. L-NAME显著抑制鼻咽癌裸鼠移植瘤的生长,诱导鼻咽癌组织坏死,而且下调移植瘤中干细胞因子的表达和CSC比例,提示NOS抑制可能成为靶向鼻咽癌干细胞的治疗措施；4.鼻咽癌组织中表达NOS1和NOS2,其中NOS2表达与鼻咽癌分级关系密切,提示NOS2可能成为鼻咽癌预后和治疗的标志物；