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脂肪酶(Lipase,E.C.3.1.1.3)不仅具备水解能力,还可以参与酯化、转酯酯酯、醇解、酸解等反应。目前,脂肪酶已被广泛应用于食品、洗涤、造纸、纺织等工业中。微生物来源的脂肪酶具有生产周期短、产量高等优点,但野生型脂肪酶耐热性差从而严重制约了脂肪酶在工业领域高温环境中的应用。本研究以来自圆弧青霉(Penicillium cyclopium)碱性脂肪酶Ⅰ (PCL)为研究对象,采用分子进化手段获得热稳定性提高的突变体,并对其酶学性质和构效关系进行研究。主要的研究结果如下:通过提取圆弧青霉的总RNA,经过反转录和PCR获得脂肪酶Ⅰ的基因pcl,并连接表达载体pET-22b(+),得到重组质粒pET-pcl并转入表达宿主Escherichiacoli BL21(DE3)中,构建重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET-pcl用于表达PCL(WT)。以pET-pcl为模板,通过重叠PCR技术,定点突变获得26个PCL突变体,经过酶活和热稳定性的检测,只有11个突变体表现出有酶活,但没有突变体的热稳定性得到提高。以pET-pcl为模板,通过易错PCR技术,筛选获得一个热稳定性显著提升的突变体,造成2个氨基酸Leu41Pro和Gly47Ile发生变化,命名为L41P/G47I。另外,通过重叠PCR技术,构建获得两个单点突变体,分别为L41P和G47I。通过亲和层析,制备获得纯化后的WT、L41P、G47I及L41P/G47I。对各重组酶酶学性质进行分析:L41P、G47I和L41P/G47I的最适温度相较于WT由25℃提高至30℃。此外,L41P、G47I 和 L41P/G47I 在 45℃的T1/2分别为 WT 的 7、13 和 9 倍;各重组酶的最适pH均为10.0,且在pH 9.0、pH 10.0和pH 11.0下的稳定性接近。另外,L41P、G47I和L41P/G47I的Km、kcat和kcat/Km相对于WT无明显变化。对热稳定性最优的G47I催化丙酸和乙醇生成丙酸乙酯的条件进行优化,丙酸乙酯转化率达到45%。同样条件下,L41P、L41P/G47I和WT的转化率分别为23%、27%和8%。结合圆二色谱和荧光光谱及三维结构分析,阐明对突变体结构与功能之间的关系:41位氨基酸位于蛋白表面,随着Leu替换成Pro,增加了蛋白表面亲水性,同时Pro中的吡咯烷的构象变化减少了 loop的灵活性,从而稳定了高温下蛋白结构;47位氨基酸位于蛋白内部,Gly变成Ile后,增加了蛋白内部疏水性,并有助于形成β-折叠的倾向性,从而提高了蛋白的热稳定性。