论文部分内容阅读
家蚕是鳞翅目模式昆虫，化性是家蚕重要的生理性状。化性是指昆虫一年发生的世代数，滞育是指在不利环境到来之前昆虫停滞发育的现象。家蚕以卵滞育，参照其卵滞育情况可将家蚕品种划分为一化性、二化性及多化性。滞育激素是家蚕滞育的主要调控因子，此外，保幼激素和蜕皮激素对家蚕滞育也有一定的影响。家蚕滞育还受温度、光周期、湿度及食物等环境因素的影响。传统的家蚕遗传学认为，调控家蚕化性的基因是位于第6连锁群上的化性主基因V，呈V1>+V>V3；以及位于第1连锁群上的伴性成熟基因Lm，呈Lm>+Lm>Lme。V基因的作用受到位于Z染色体上的伴性早熟基因Lme的影响，Lme的存在促进家蚕化性向多化性方向迁移。本研究在对无滞育多化性家蚕品种nistari Z染色体上的伴性早熟基因Lme基因进行遗传分析的基础上，用nistari和p50构建了Lme的精细定位群体。利用二化性家蚕品种p50低温催青产非滞育卵的特性，及家蚕品种54A滞育性对环境因素不敏感的特点，构建了家蚕化性主基因V的等位基因+V定位分析群体。在本研究早期，对引自印度的无滞育多化性家蚕品种nistari常染色体上的化性调控基因遗传分离材料进行生物统计学分析时发现，nistari常染色体上可能存在多个化性调控基因。因此，本研究通过遗传育种技术、分子标记技术、HRM分析技术分别对伴性早熟基因Lme和化性基因+V进行定位分析；此外，本实验将重点构建无滞育多化性家蚕品种nistari的遗传模式。主要研究成果如下：（1）伴性早熟基因Lme的精细定位选择无滞育多化性家蚕品种nistari作为雌性亲本（P1）与二化性家蚕品种p50作为雄性亲本（P2）进行杂交，组配F1代；F1代雄性个体回交雌性亲本p50，构建BC1M群体。用P1、P2和F1筛选与Lme基因连锁的多态性SSR分子标记；用BC1M群体中734头产非滞育卵雌蛾对Lme基因进行定位分析。利用HRM分析技术在第1连锁群筛选到10对多态性SSR分子标记，用这些分子标记对定位群体中的个体基因型依次进行分型。基于基因型分型结果，采用Mapmaker3.0绘制出家蚕伴性早熟基因Lme的遗传连锁图，确定Lme基因与各标记之间的遗传距离。绘制出的连锁图的总的遗传距离为12.91cM，Lme基因位于标记S2734-299和S2734-525之间，两标记之间的物理距离为226kb，与Lme基因的遗传距离均为0.41cM，实现了伴性早熟基因Lme的精细定位。（2）化性基因+V的定位分析选择二化性家蚕品种p50作为雌性亲本（P1）与家蚕品种54A作为雄性亲本（P2）进行杂交，组配F1代群体；F1代雌性个体回交雄性亲本54A构建BC1F群体；BC1F群体中雄性个体回交雌性亲本p50构建BC2M回交群体。低温催青BC2M回交群体，严格控制饲养温度，子代产滞育卵卵圈与非滞育卵卵圈的比例为3:1。在BC2M回交群体中，共获得产完全生种雌蛾132头、产部分生种雌蛾178头。利用HRM分析技术筛选出12对与家蚕化性基因+V连锁的SSR分子标记，用这些标记对BC2M回交群体中310头产非滞育卵雌蛾依次进行基因型分型。基于基因型分型结果，采用Mapmaker3.0绘制出家蚕化性基因+V的遗传连锁图，确定+V基因与各标记之间的遗传距离。绘制出的连锁图的总的遗传距离为52.44cM，初步完成了化性基因+V的定位分析。（3）无滞育多化性家蚕品种nistari的连锁分析由于多化性家蚕品种nistari的化性调控模式非常复杂，所以在本实验中分别尝试构建nistari与p50的F2代、F3代连锁分析群体。选择无滞育品种nistari作为隐性纯合多化性基因亲本、p50作为显性纯合二化性基因亲本进行杂交，构建F1代（nistari×p50），F1代采用单蛾区饲养，F1代雌蛾均产滞育卵。F1代蛾区内自交，构建F2代连锁分析群体。对F2、F3代群体进行初步分析，结果令人十分意外，用第6连锁群的家蚕眠性基因定位标记s2853-65、s06-1等反复验证后发现，相当比例的个体其多化性表型与第6连锁群无连锁关系。据此，我们推测传统遗传学所述的化性基因V3并不是无滞育多化性家蚕品种nistari的主要多化性调控基因，或者说化性基因V3并不是nistari产非滞育卵特性的必要条件。选择无滞育品种nistari作为隐性纯合多化性基因亲本、p50作为显性纯合二化性基因亲本进行杂交，构建F1代（nistari×p50），F1代采用单蛾区饲养，F1代雌蛾均产滞育卵。F1代雌蛾回交显性亲本p50，构建BC1F代回交群体。蛾区饲养BC1F代群体，采用蛾区内自交制得F3代连锁分析群体。F3代群体在家蚕第27条染色体上的连锁分析结果显示：大部分个体的多化性表型与第27连锁群存在连锁关系；用其余26个连锁群标记进行检测发现有少部分个体与第22连锁群上的标记S2209以及第26连锁群上的标记S2601、S1907连锁，而约有80个雌蛾与第5连锁群上的标记S2529-4连锁。因此，在第5染色体上可能存在与nistari多化性相关的隐性基因。