研究背景:由基因突变诱发的各类遗传疾病对人类的健康带来了巨大的威胁,如先天愚型、多指(趾)、先天性聋哑、血友病等。这些疾病多由遗传因素决定,基因突变后导致了基因结构、功能及其编码信息的改变,产生对应疾病表型。且突变基因在细胞增殖过程中能够自我复制,产生一系列后续影响,代代相传。由此,致病突变的出现不仅影响患者自身的健康,同时也会影响子代健康。在人类基因组中已知的约25,000个注释基因中,约有3,380个基因存在与疾病表型相关联的突变。并且随着测序技术的快速发展以及对疾病发病机制认识的深入,更多的疾病相关联的基因组突变将会被揭示。由基因突变导致的蛋白功能改变诱发的遗传病发病机制和临床治疗仍然是国际上尚未解决的难点科学问题。如何通过学科交叉,进一步解析该类疾病发病机制并拓展疾病治疗靶点研究范畴,为临床基因治疗提供新的方式及思路,是我们需要努力的重要方向。以核酸酶为基础的基因编辑手段的出现为遗传病的治疗提供了一种新的方式。从锌指核酸酶(Zinc-Finger Nuclease,ZFN)到转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nucleases,TALEN),再到CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated proteins)体系,每一种核酸酶介导的基因编辑技术的革新都将基因治疗领域向前推进一大步,尤其是CRISPR/Cas9体系。Cas9蛋白在短的引导RNA(small guide RNA,sgRNA)引导下,可以结合到基因组特定位点,并发挥其核酸酶活性,在该位点引入DNA双链断裂。双链断裂后,细胞可以经由多种方式对断裂部位进行修复,常见的主要为非同源末端修复(Non-homologous End Joining,NHEJ)及同源重组修复(Homology Directed Repair,HDR)。HDR可以根据同源修复模板,对断裂部位进行精准修复或是外源DNA片段定点插入。HDR修复方式,可以对基因组中突变位点进行精准修复,在诸多由突变导致的蛋白功能异常诱发的遗传病的治疗中有着重要的应用前景。但是,目前存在的问题是HDR修复方式效率低,严重制约了其在临床上的应用。如果可以利用CRISPR/Cas9系统为技术手段,提高HDR介导的精准基因修复或DNA片段定点插入效率,将为遗传性疾病治疗提供新方法和新策略。研究目的:本研究以CRISPR/Cas9系统为技术手段,通过优化其作用体系,对DNA双链断裂后自我修复相关的关键蛋白的表达进行激活或抑制调控,实现DNA双链断裂损伤后的修复方式有目的的引导,提高HDR修复效率。同时结合Tet/on系统及慢病毒表达系统,对HDR修复方式进行高效的调节。更为重要的是,我们将该方法应用于病人来源的iPSC,期望实现针对致病基因更高效率的矫正。本研究聚焦于CRISPR/Cas9系统在HDR修复效率上的不足,通过对其结构进行优化,并结合药物调控等方法,实现DNA损伤修复过程中关键蛋白的表达的高效调控,为提高HDR介导的精准基因修复或DNA片段定点插入效率提供一种切实可行的策略,有望为CRISPR/Cas9系统的临床基因治疗提供新的思路和依据。研究方法与结果:本项目通过对CRISPR/Cas9系统进行结构优化,在sgRNA原有的颈环结构中融合MS2或com颈环。将转录激活因子及转录抑制因子分别与可以和MS2及com颈环结构结合的适配子蛋白MCP、COM融合表达。同时,将20nt的sgRNA长度缩短为14-16 nt的dgRNA,引导Cas9蛋白对DNA损伤修复相关的基因的表达进行激活或抑制调控。利用rt-qPCR及免疫荧光等分子生物学手段对其激活或抑制效率进行评价。进而采用Traffic Light Reporter(TLR)稳定表达细胞株及内源位点荧光报告信息插入等方法,利用流式细胞仪对筛选得到的基因在HDR/NHEJ修复方式中的调控作用进行评价。主要结果总结如下:(1)激活CDK1及CtIP的表达,或是抑制KU70、KU80及Ligase Ⅳ的表达,可以显著提高HDR修复效率。尤其是对CDK1和KU80的表达同时进行调控,可以最大效率的提高HDR效率,与对照组相比有13倍提高。(2)在内源AAVS位点、ACTB位点进行EGFP荧光报告片段插入,实验分析发现EGFP阳性细胞数目在基因调控组明显增多,相似的实验结果在Hela及HEK293T细胞系中均得到很好重复。(3)利用Tet/on系统高效、无毒、调控可逆等特点,我们对转录激活因子或抑制因子的表达进行可逆调控。当有Doxycycline存在时,CDK1基因的表达明显被激活,KU80的表达明显被抑制,与之相一致的是细胞内HDR修复效率明显提高。为进一步提高质粒转染效率,同时实现基因转录的长时程调控,将激活相关元件构建至慢病毒载体,HDR修复效率得到明显提高。(4)非常重要的是,我们将该系统应用在遗传性耳聋病人来源的iPSC细胞中,发现激活细胞内CDK1的表达,可以显著提高iPSC细胞中遗传性耳聋致病突变位点的矫正效率。结论:对CRISPR/Cas9系统进行结构优化,可以同时在一个细胞中实现基因表达调控及基因编辑操作;对DNA损伤修复过程中关键蛋白的表达进行调控,可以明显提高HDR修复效率;在本项研究中,激活CDK1基因表达的同时抑制KU80的表达,可以显著提高HDR修复效率;激活CDK1表达,可以提高病人来源iPSC细胞中致病突变位点的矫正效率。综上所述,本研究为提高HDR介导的精准基因修复或DNA片段定点插入效率,提供一种切实可行的新策略,有望为CRISPR/Cas9系统的临床基因治疗提供新的思路。