研究背景异柠檬酸脱氢酶(Isocitrate Dehydrogenase,IDH)是三羧酸循环中异柠檬酸被催化生成α-酮戊二酸的限速酶。IDH家族有NADP和NAD依赖型两种,NADP依赖型的酶有IDH1和IDH2, NAD依赖型的有IDH3。IDH1存在于细胞质基质和过氧化物酶体中,IDH2存在于线粒体中,IDH3存在于线粒体中。idhl基因位于斑马鱼9号染色体上,在ensembl数据库中有两个转录本idhl-201和idh1-202。idhl-201含有9个外显子,转录本长度1995bp,编码429个氨基酸。idhl-202含有10个外显子,转录本长度1977bp,编码423个氨基酸。idh2基因位于斑马鱼18号染色体上,在ensembl数据库中含有两个转录本idh2-201和idh2-202。idh2-201有24个外显子,转录本长度1650bp,编码450个氨基酸。idh2-202有16个外显子,转录本长度1641bp,编码447个氨基酸。idh3基因位于斑马鱼23号染色体上,在ensembl有3个转录本idh3-201,idh3-003和idh3-001。idh3-201有13个外显子组成,转录本长度2475bp,编码391个氨基酸,idh3-003有14个外显子组成,转录本长度2470bp,编码391个氨基酸,idh3-001有5个外显子组成,转录本长度1565bp,编码66个氨基酸。IDH3由2个α亚基,一个β亚基和一个γ亚基组成了异源四聚体,在癌变过程中IDH3起了关键性的作用。但是在造血方面暂时还没有idh3基因发生突变的报道,因此在此文中idh3基因不是我们研究的重点。有研究发现人胶质母细胞瘤中发生了idhl和idh2基因的突变,并且在骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓及外骨髓增生肿瘤(MPN)、慢性髓单核细胞白血病(CMML).急性髓系细胞白血病(AML)和淋巴肿瘤中也检测到IDH发生了突变。idhl和idh2基因一般发生杂合突变,在血液疾病中IDH发生最常见的突变是单个氨基酸的突变。在大部分病人中发现IDH1蛋白发生的突变位点常常在翻译生成的肽链序列的第132号位点发生,132号位点的精氨酸突变成了组氨酸(R132H),IDH1蛋白发生正常作用时形成的是同源二聚体,产生的α-酮戊二酸被PHD所利用,促进缺氧诱导因子(HIF-la)发生加羟基作用,随后发生降解,在肿瘤细胞中IDH1蛋白一个亚基发生突变,形成了无正常功能的蛋白,缺氧诱导因子不能产生加羟基作用,不能发生降解,随后诱导一些肿瘤相关的因子产生,像葡萄糖运输因子1(Glucose transporter1,Glut1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF).磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase,PGK1),这些因子促使肿瘤细胞发生大量增殖,这也提示idhl基因更可能的功能是肿瘤抑制基因而不是原癌基因。IDH2则是在翻译生成的蛋白序列第140个氨基酸和第172个氨基酸发生突变,140号位的精氨酸突变生成了谷氨酰胺(R140Q),172号位的精氨酸突变生成了赖氨酸(R172K)。突变的IDH1/2导致异柠檬酸生成α-酮戊二酸的过程发生了阻碍,正常的a-酮戊二酸生成量降低,转而生成了大量的不正常产物D-二羟基戊二酸。因此二羟基戊二酸可以作为检测IDH1/2突变导致的血液疾病标记物。除了IDH1/2突变直接影响外,该基因还通过影响某些基因的甲基化,引起特定通路中相关基因的表达或抑制间接引起疾病。比如说tet2 (TET家族甲基化胞嘧啶双加氧酶),在斑马鱼胚胎中,TET分子参与5-甲基胞嘧啶(5mC)加羟基生成5-羟甲基胞嘧啶(5hmC),5hmC调控红细胞前体细胞的形成和分化。体外实验中,IDH1/2突变体白细胞表达增多,这症状与tet2缺失导致的干细胞标志物增多和髓系细胞分化减少是一致的。IDH1/2突变使tet2的功能受影响,从而影响tet2维持和造血相关的基因的甲基化。IDHl/2突变的小鼠表现出5hmC水平的大量降低。这个现象说明D-二羟基戊二酸生成抑制了tet2蛋白的活性。正常细胞中IDH1/2催化异柠檬酸生成α-酮戊二酸,tet2在a-酮戊二酸的作用下招募DNA去甲基化酶使某个基因启动子位点发生去甲基化作用,DNA转录相关的因子便结合在该位点,引起基因发生转录,使基因行使表达功能。当IDH发生突变,生成了D-二羟基戊二酸,这个时候tet2便不能招募DNA去甲基化酶,基因启动子位点的DNA甲基化酶占有主导地位,使该位点持续甲基化,这个时候基因便不能转录,即不能表达出功能,使基因发生沉默。假如该基因是维持生命活动的重要基因,便会使人产生疾病。通过比对人、小鼠、斑马鱼的IDH1/2基因,我们可以看到它们的基因还是相当保守的,比如说IDH1蛋白肽链132位点,IDH2蛋白肽链的140和172位点。大量的细胞实验、敲除小鼠IDH1和IDH2保守位点实验以及一些血液疾病的临床病人样本检测都发现IDH1/2突变是导致造血异常的一种致癌基因。但是还没有一个好的模型能够来研究idhl/2基因突变导致的血液疾病,斑马鱼由于自身的生物学优势,能够很好的回答idhl/2基因突变造成的造血异常,因此被用来研究血液疾病。这篇文章主要想通过Talen的方法敲除斑马鱼中的idhl和idh2基因,筛选出突变的斑马鱼,检测造血的淋系,髓系,红系等各个谱系,建立造血异常的斑马鱼突变疾病模型。基因敲除是证明基因功能不可缺少的逻辑环节,是基因工程和基因治疗的重要手段,常见的基因敲除方法有自杀质粒,RNAi, ZFN(锌指核酸酶),但是自杀质粒这种敲除方法同源重组几率低,操作难度大,RNAi是一种临时性的敲除方法,不能稳定遗传下去。ZFN设计依赖上下游序列、脱靶率高、具有细胞毒性,且只能在体外操作,再输回病人体内,操作复杂,容易引起免疫反应,因此难以推广使用。这个时候我们就需要一种新的敲除方法,Talen敲除方法就避免了以上几种敲除方法的缺点。该方法基于Talen (transcription activator-like (TAL) effector nucleases)靶向基因敲除,原理是Talen真核表达载体表达一个重组核酸酶,在靶点识别结构域的作用下,识别靶点核酸序列,核酸酶发挥内切酶活性,打断目的基因,触发DNA同源重组或非同源末端连接,重组过程中发生修复错误就导致了基因发生突变,从而达到基因敲除的目的。1989年,植物病原体黄单胞菌属(Xanthomonas spp.) avrBs3基因被克隆,2007年发现其序列特异性核酸结合特性,avrBs3-TA,2009年XanthomonasTA氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译：由34个aa重复序列组成一个单元,重复17-18次；34个氨基酸中的第12和13个氨基酸(Repeat Variant Di-residue, RVD)对应识别一个目标碱基。RVD与碱基A、G、C、T有恒定的对应关系,即NI识别A,NG识别T,HD识别C,NN识别G,欲使Talen特异识别某一核酸序列,只须按照靶点序列将相应TAL单元(14-18个)串联克隆即可。Talen基因敲除基本步骤主要包括：1.确定靶点：选择目标基因外显子中相隔17-18bp的两段14-18bp序列作为靶点；2.TAL靶点识别域的克隆构建；3.将TAL靶点识别域克隆入特定的真核表达载体：4.将重组真核表达质粒转录生成的mRNA显微注射进斑马鱼单细胞受精卵中以表达重组核酸酶,敲除基因；5.筛选突变体。目前TALEN系统利用Fokl的内切酶活性打断目标基因。因Fokl需形成二聚体方能发挥活性,在实际操作中需在目标基因中选择两处相邻(间隔17碱基)的靶序列(14-18个碱基)分别进行TAL识别模块构建。当构建好的Talen表达载体注射入斑马鱼的胚胎中,下一步我们要做的就是检测敲除效率,筛选出突变体。我们可以利用实验设计时挑选的,位于相邻靶位点之间的特异性内切酶位点,进行PCR产物酶切鉴定以筛选发生目标基因敲除的突变个体。当左右靶点之间没有合适的酶切位点时可使用CEL-I核酸酶检测。由于通过单元组装法能够构建任何序列的识别蛋白,因此从理论上来说TALEN技术可以敲除任何基因。本文通过TALEN技术敲除异柠檬酸脱氢酶基因,获得该基因突变的斑马鱼,初步探讨不同突变类型的斑马鱼突变体是否能够导致某些造血方面的表型出现。本文分为实验材料,实验方法,结果与分析,讨论及全文总结,展望5部分。目的：通过人工构建Talen靶向敲除载体敲除idhl/2基因,筛选出突变体,并进行一些造血方面相关谱系表型鉴定。方法：采用单元组装法构建靶向敲除idhl/2基因的载体,通过试剂盒在体外转录成Talen mRNAs,通过显微注射方法注入单细胞时期的受精卵中,胚胎期检测Talen敲除效率,再通过剪尾、PCR、酶切、测序筛选出发生基因突变的成年斑马鱼及突变的类型,然后通过斑马鱼胚胎整体原位杂交,实时荧光定量PCR,吉姆萨染色,苏丹黑B染色鉴定突变的斑马鱼造血相关表型。结果：构建完成的TALEN载体,PCR及酶切发现插入了组装的TALE序列。显微注射进斑马鱼胚胎中,检测效率达到预期。将敲除有效率的斑马鱼养大,剪尾,提DNA, PCR酶切跑胶,测序证实成功构建了idhl/2突变的斑马鱼,并且在各种突变类型的斑马鱼中暂时没有发现与造血相关表型出现,猜想idhl/2基因突变导致的造血异常可能是多种基因相互作用结果,需要进一步找到与idhl/2基因相互作用的基因。结论：成功构建idhl/2基因敲除的斑马鱼动物模型,为进一步研究人类idhl/2基因突变引起的血液疾病发病机制提供了良好的动物模型。由于造血作用是一个复杂的过程,想完全弄明白还是一个具有挑战的事情,我们只能初步模拟idhl/2基因在人类中目前已经发现的与造血相关的突变位点,期望弄清楚idhl/2突变导致血液疾病如白血病的机制。