研究背景与目的急性髓系白血病(acute myeloblastic leukemia, AML)是一种以成髓细胞失控性增殖为特征的危及生命的恶性疾病,AML的临床进展和预后与侵袭细胞类型、基因遗传学改变及克隆的生物学特性紧密相关。临床上针对AML治疗的化疗药物或靶向药物虽然能够提高完全缓解率(CR),但基于AML中存在具有自我更新和增殖的干细胞群,故患者体内有可能存在无法清除的白血病微小克隆而导致缓解后复发。因此,寻找有效治疗AML的天然或合成药物已经成为肿瘤研究者研究的目标之一。AML的发生历经了免疫监视、相互对抗和免疫逃逸的免疫选择和编辑过程,机体的免疫细胞无法对其进行杀伤。NKG2D是免疫细胞表面的激活性受体,在NK细胞、NK／T细胞、Tγδ细胞、DC细胞、IDC细胞等多种细胞表面表达。这些免疫细胞可以通过NKG2D分子识别肿瘤细胞表面的相应NKG2D配体而被激活,表达TRAIL、Fas L、颗粒酶、穿孔素,从而诱导靶细胞凋亡或直接杀伤,产生有效的抗肿瘤免疫应答。研究证实,多种药物具有上调肿瘤细胞表面的NKG2D配体表达的作用,因而提高肿瘤细胞被NK细胞杀伤的敏感性,对肿瘤细胞进行有效清除。蛇毒毒素在肿瘤防治方面具有良好的效果。研究发现,蛇毒毒素对人卵巢癌、膀胱癌、侵袭性前列腺癌、急性早幼粒白血病等均具有抑制作用,作用机制与调节肿瘤细胞凋亡相关基因表达有关。本实验所用中华眼镜蛇毒组分(Naja Naja Actra Venom Component, NNAVC)即是从中华眼镜蛇毒液中提取的具有抗肿瘤作用的成分。本研究以人急性髓系白血病细胞株KG1a细胞为研究对象,以NNAVC和活化免疫细胞为干预因素,探讨：①NNAVC与活化免疫细胞联合对白血病模型鼠体内实验研究；②NNAVC对KG1a细胞增殖抑制及凋亡诱导作用；③NNAVC诱导KG1a细胞的相关分子机制；④NNAVC与活化免疫细胞联合对KGla细胞的杀伤作用及二者共同作用的关联性。本研究通过体内外实验对NNAVC在AML治疗方面的作用进行初步探讨,为寻求难治性复发性白血病的治疗策略提供理论和实验依据。方法第一章NNAVC单独及与活化免疫细胞联合对白血病模型鼠体内实验研究选用Balb/c-nu小鼠为实验动物,尾静脉注射KG1a细胞建立Balb/c-nu小鼠白血病模型,以外周血及骨髓细胞形态学、荷白血病细胞小鼠骨髓原代细胞培养、FISH检测Y染色体、膜抗原检测、免疫组化检测人特异性抗原等证明白血病模型的成功建立；选用正常Balb/c-nu小鼠,腹腔注射不同剂量的NNAVC,以小鼠体重、行为变化及组织病理切片评价NNAVC的毒副作用；制备KG1a白血病模型,观察NNAVC单独及与活化免疫细胞联合对白血病模型生存时间的影响。第二章NNAVC对KG1a细胞增殖抑制及凋亡诱导作用用台盼蓝拒染法测定NNAVC对KG1a细胞生长曲线的影响；倒置显微镜下观察NNAVC作用前后KG1a细胞形态变化；以MTT法测定NNAVC处理后KG1a细胞的增殖活性,并计算半数抑制浓度(IC50)；甲基纤维素半固体培养法检测NNAVC对KG1a细胞体外克隆形成能力的影响；PI染色流式细胞仪检测细胞周期分布；采用Annexin V/PI双标记,荧光显微镜观察细胞凋亡形态,流式检测仪检测NNAVC诱导KG1a细胞的凋亡率；DNA Ladder实验对NNAVC能够诱导KG1a细胞凋亡进行验证。第三章NNAVC诱导KGla细胞的相关分子机制以RT-PCR方法检测凋亡通路调节分子Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Bak、Bad、Bid、PUMA、NOXA、p53、NF-kB的mRNA表达水平；用人细胞色素C ELISA检测试剂盒检测NNAVC处理后KG1a细胞内细胞色素C的蛋白表达水平；以分光光度法检测Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达；以流式细胞术检测TRAIL死亡受体和诱骗受体蛋白表达。第四章NNAVC与活化免疫细胞联合对KGla细胞的杀伤作用用淋巴细胞分离液分离健康供者外周血单个核细胞(PBMC),体外用细胞因子刺激培养活化免疫细胞；CCK-8法检测不同浓度NNAVC对’PBMC和活化免疫细胞的细胞毒作用；采用不同健康供者来源的活化免疫细胞序贯杀伤KG1a细胞,LDH杀伤活性检测试剂盒测定KG1a细胞经不同次数活化免疫细胞诱导杀伤作用后,对不同效靶比时活化免疫细胞杀伤敏感性的变化；LDH释放法检测NNAVC联合活化免疫细胞对KG1A细胞的细胞毒性作用；甲基纤维素半固体培养法检测NNAVC单独及与活化免疫细胞联合对KG1A细胞体外克隆形成能力的影响；以流式细胞术检测NNAVC作用后KG1a细胞表面NKG2D配体表达的变化。结果第一章NNAVC单独及与活化免疫细胞联合对白血病模型鼠体内实验研究1.1 KGla细胞白血病模型的鉴定1.1.1白血病模型的细胞形态：根据每周一次外周血涂片分析,小鼠经尾静脉注射KG1a细胞后4-5周开始在外周血发现白血病细胞,形态与KG1a细胞具有高度一致性。随着时间的延长,白血病细胞数量逐渐增多。1.1.2来源于白血病模型小鼠骨髓细胞的原代培养来源于白血病模型小鼠骨髓细胞培养3-4周后开始进入对数生长期,细胞形态与KG1a细胞相似,可进行稳定传代。1.1.3 KG1a细胞白血病模型小鼠骨髓培养细胞表面标志流式细胞仪检测正常小鼠骨髓细胞、KG1a细胞和白血病模型小鼠骨髓培养细胞的CD34和CD38抗原表达情况。正常小鼠骨髓细胞群中几乎无法检测到此两种抗原(CD34-CD38-为99.76%)；KG1a细胞CD34+CD38-的表达率为32.74%,CD34+CD38+的表达率为66.87%；白血病模型小鼠骨髓培养细胞CD34+CD38-的表达率为83.06%,CD34+CD38+的表达率为16.72%。以上结果提示模型组小鼠骨髓内有人白血病细胞存在,且浸润的KG1a细胞大部分处于干细胞水平,应具有较强致病力,证明KGla细胞白血病模型建立成功。1.1.4白血病模型小鼠骨髓培养细胞染色体检测荧光原位杂交(FISH)实验结果显示,正常小鼠的骨髓细胞内无法检测到Y染色体,KG1a细胞内性染色体为XY,来源于白血病模型小鼠骨髓的培养细胞内性染色体也为XY。本实验所用小鼠均为雌性,而KG1a细胞是从一位男性AML患者体内获得,因此,以上结果提示模型小鼠体内已经存在人KG1a细胞。1.1.5白血病模型小鼠多器官浸润检测根据病理切片HE染色和免疫组化检测,观察白血病模型小鼠体内多脏器的白血病细胞浸润情况。结果显示,模型小鼠肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等器官均有白血病细胞存在,其中肝脏的浸润情况最为严重；免疫组化检测发现,浸润的白血病细胞表面表达人特异性CD34和CD45抗原,说明模型小鼠体内的白血病细胞是实验操作获得的人源性细胞,而非小鼠自发产生的。1.2 NNAVC对Balb/c-nu小鼠的毒性作用1.2.1小鼠生存质量在注射NNAVC期间,各组小鼠精神状态良好、饮食活动正常,无明显躁动、惊恐不安、萎靡不振、拒食等现象,注射部位皮肤无红肿破溃或感染化脓表现,实验时间内各组小鼠无死亡。1.2.2 NNAVC对小鼠体重及脏器质量的影响观察结果显示,各组小鼠在实验前后体重变化差异有显著性意义(F=15.624,P=0.002)；不同处理组间小鼠体重的差异无显著性意义(F=0.361,P=0.704)：NNAVC作用10天后,各药物组小鼠体重均较给药前有所增加,但与阴性对照组相比,体重变化无显著性差异(P=0.425,P=0.654)。根据公式计算各组小鼠心脏、肝脏、肾脏、肺脏、脾脏的脏／体系数,结果表明,NNAVC高、低剂量组的各组脏／体系数与阴性对照组相比差异无统计学意义(P=0.124,P=0.435,P=0.352,P=0.403,P=0.663)。脏／体系数是反映药物对动物脏器毒性作用的指标之一,因此,本实验结果提示此两种剂量的NNAVC对正常Balb/c-nu小鼠的体重和脏器质量无明显毒性作用。1.2.3组织病理学变化光镜下观察,药物组与对照组相比,各组织器官无明显病理学改变。1.3. NNAVC和活化免疫细胞对白血病模型生存率及生存时间的影响1.3.1小鼠生存质量制备白血病模型期间,各组小鼠精神状态良好、饮食活动正常,注射部位皮肤及周围组织无炎症感染表现。观察小鼠生存期期间发现,死亡前一周左右小鼠出现饮食饮水量下降、活动减少、萎靡不振等现象,部分小鼠体表有红色斑点出现(见于面部、背部、后肢或臀部,数量一般为1-2个,小鼠体温正常,无创伤感染表现),体重持续下降,一周内死亡1.3.2各组KG1a细胞白血病模型小鼠生存时间观察观察接种KG1a细胞后各组小鼠生存时间：阴性对照组小鼠在接种细胞后52天内全部死亡,其中位生存时间是50(34,66)天；NNAVC低剂量(0.04mg/kg)组和高剂量(0.08mg/kg)组的中位生存时间分别是43(41,45)天和61(35,87)天；活化免疫细胞组小鼠中位生存时间为52(38,66)天；联合组(NNAVC高剂量与活化免疫细胞联合)小鼠中位生存时间为71(58,84)天；阳性对照组(柔红霉素2.5mg/kg)小鼠中位生存时间为53(39,67)天。除联合组小鼠生存期显著高于阴性对照组(P=0.025)外,其余各处理组生存期与阴性对照组相比均无显著性差异(P=0.277,P=0.197,P=0.341,P=0.197)；NNAVC低剂量(0.04mg/kg)组小鼠生存时间低于高剂量组,二者比较差异有显著性意义(P=0.025)；联合组与NNAVC高剂量(0.08mg/kg)组小鼠的存活时间比较差异无统计学意义(P=0.110),但与活化免疫细胞组比较差异有显著性(P=0.025)。以上结果表明,白血病小鼠生存期随着NNAVC药物剂量增加而延长,而活化免疫细胞与高剂量NNAVC联合应用的疗效优于二者各自单独作用的效果。1.3.3 NNAVC和活化免疫细胞对白血病模型小鼠脏器质量的影响各组白血病小鼠经处理后,至生存期结束时各器官脏／体系数变化数据显不,NNAVC低剂量组心脏系数与正常对照组相比较差异有显著性意义(P=0.001)；各组肝脏系数无明显变化(F=2.176,P=0.108)；阴性对照组、NNAVC低剂量组及高剂量组小鼠脾脏系数与正常对照组比较差异有显著性意义(P=0.000,P=0.000,P=0.013)；阳性对照组的肺脏系数和肾脏系数均有增高趋势,与正常对照组相比差异有统计学意义(P=0.000,P=0.011),活化免疫细胞组肾脏系数与正常对照组相比差异也有统计学意义(P=0.009),其余各组肺脏系数和肾脏系数差异无显著性(P>0.05)。而与阴性对照组(即白血病模型组)比较,活化免疫细胞组、联合组及阳性对照组的脾脏系数均升高,差异有统计学意义(P=0.000,P=0.000,P=0.000)；活化免疫细胞组和阳性对照组的肾脏系数与阴性对照组相比差异有显著性意义(P=0.008,P=0.009)。第二章NNAVC对KG1a细胞增殖抑制及凋亡诱导作用2.1 NNAVC作用后KG1a细胞生长曲线的变化台盼蓝拒染法结果显示,低浓度NNAVC (0.625μg/ml)组KG1a细胞的生长曲线斜率明显低于对照组,表现出有效的增殖抑制作用；药物终浓度达1.25μg/ml时,细胞增殖相当缓慢,生长曲线趋于平整；当NNAVC浓度≥2.5 u g/ml时,KG1a细胞在24h内几乎全部死亡。提示NNAVC可以有效抑制KG1a细胞的生长增殖,并且随着其浓度的增加、作用时间的延长,增殖抑制作用逐渐增强,抑制效应具时间和剂量依赖性。2.2 Zeiss倒置显微镜进行细胞形态学观察结果显微镜镜下观察,KG1a细胞加药前状态良好,细胞壁完整、光滑透亮、胞浆均匀、细胞形态规则。加入NNAVC作用后连续动态观察24h,结果显示KG1a细胞作用6h后开始出现细胞壁不完整、细胞形状不规则、胞浆颗粒增多等改变,随着NNAVC作用时间的延长,发生上述形态改变的细胞数量逐渐增多。至NNAVC作用24h后,可以看到明显的细胞死亡,细胞质空泡、固缩、细胞破碎等形态学变化。2.3 NNAVC对KG1a细胞的细胞毒作用细胞毒性实验结果显示,NNAVC不同作用浓度与作用时间之间有交互效应(F=11.868,P=0.000)；不同NNAVC浓度对KG1a细胞的抑制率之间比较差异有显著性意义(F=934.427,P=0.000)；两个作用时间NNAVC刘‘KG1a细胞的抑制率比较有显著性差异(F=1074.672,P=0.000)。NNAVC在0.6μg/ml至1.2μg/ml的浓度范围内,在相同作用时间时,对KG1a细胞的生长抑制作用具有递增趋势,差异比较有统计学意义(F=428.725,P=0.000；F=550.172,P=0.000)；在相同浓度条件下,NNAVC处理KG1a细胞在24h与48h时间点的抑制率具有显著性差异(t=-11.549,P=0.000；t=-14.190,P=0.000；t=-13.219,P=0.000；t=-13.194,P=0.000；t=-10.218,P=0.001；t=-15.272,P=0.000；t=-10.436,P=0.000；),抑制率随着作用时间的延长而增加。说明NNAVC对KG1a细胞的增殖抑制作用具有剂量依赖性和时间依赖性。NNAVC对KG1a细胞IC50浓度在24h为0.8806(0.8654-0.8959)μg/ml,48h为0.7037(0.6875-0.7187)μg/ml.2.4 NNAVC对KG1a细胞集落形成能力的影响用甲基纤维素半固体培养体系进行培养,KG1a细胞接种后第1-2天为分散的单个细胞,第7天即可见克隆形成,7-14天之间集落数量不断增多。各组细胞的集落形态：正常KG1a细胞形成的集落数量多,呈密集型集落；NNAVC作用后KG1a细胞形成的集落数量明显减少,细胞团内有死细胞出现,高剂量组(NNAVC 0.8μg/ml)集落较为松散,细胞碎片较多。分别对各组细胞在培养7天及14天后克隆形成数量进行统计,结果：NNAVC作用浓度与克隆培养时间之间有交互效应(F=70.623,P=0.000)；不同处理组之间克隆形成数量差别有统计学意义(F=204.351,P=0.000)；各组细胞培养不同时间所形成的克隆数量差异有显著性意义(F=305.877,P=0.000)。各组细胞在培养14天后的克隆数均显著高于培养7天时的数量,差异比较有统计学意义(t=-13.784,P=0.000；t=-8.615,P=0.000；t=-6.728,P=0.003)；在各观察时间点,不同浓度NNAVC对KG1a细胞集落形成能力均有影响,药物作用后克隆数明显降低,组内比较差异有显著性意义(F=34.357,P=0.001；F=172.368,P=0.000)；NNAVC0.8μg/ml组在各观察时间的克隆形成数量与0.7μg/m1组相比无统计学意义(P=0.411,P=0.185),但前者克隆数低于后者。根据结果分析提示,用药后各药物组细胞的增殖性下降,说明NNAVC可以在一定程度上抑制KG1a细胞的集落形成能力,从而抑制其增殖。2.5 NNAVC对KG1a细胞生长周期的影响根据流式检测结果,加入NNAVC作用24 h后,细胞周期变化如下：在细胞周期的不同时段,各组细胞的比例具有显著性差异(F=339.698,P=0.000；F=6.439,P=0.032；F=127.007,P=0.000)；NNAVC 0.7μg/ml组和0.8μg/ml组中处于G0／G1期细胞比例分别上升为58.67%和62.20%,与对照组52.93%相比差异有显著性意义(P=0.032,P=0.002),而处于G2/M期的细胞比例分别下降为5.33%和3.13%,与对照组相比有显著性差异(P=0.000,P=0.000)；0.8μg/ml组S期细胞比例为34.70%,与对照组36.90%相比差异有统计学意义(P=0.012)。NNAVC 0.7μg/ml组和0.8μg/ml组之间处于G0／G1期和S期的细胞比例比较差异无显著性(P=0.048,P=0.079),处于G2／M期细胞比例比较差异有统计学意义(P=0.003)。加药组细胞G1期前均有亚二倍体峰出现。以上结果提示,NNAVC可能通过诱导KG1a细胞生长周期阻滞于G0／G1期,减少G2／M期细胞百分含量而抑制其生长增殖,并且NNAVC还具有促使细胞凋亡的作用。2.6荧光显微镜观察细胞凋亡荧光显微镜下观察,正常细胞形态饱满、细胞着色均匀,无亮色小体,说明细胞的胞膜完整,没有凋亡小体出现。NNAVC处理组细胞发生核固缩、破裂,细胞膜出泡,有凋亡小体出现。其细胞凋亡数随药物浓度增高及作用时间的延长而逐渐增多。2.7流式检测仪检测细胞凋亡率检测结果发现,KG1a细胞经NNAVC处理后,早期凋亡率和晚期凋亡率均有所增加,其中0.7μg/ml浓度组早期凋亡率和晚期凋亡率分别增加到39.63%和22.23%,与对照组相比差异有统计学意义(P= 0.049, P= 0.034); 0.8μg/ml浓度组早期凋亡率和晚期凋亡率分别增加到40.73%和41.50%,与对照组相比有显著性差异(P=0.040,P=0.016)；而0.6μg/ml浓度组凋亡率均无明显变化；两两比较显示,0.7μg/ml和0.8μg/ml浓度组间早期凋亡率的差异无统计学意义(P=1.000),晚期凋亡率相比差异有显著性意义(P=0.021)。以上结果证实NNAVC具有诱导KG1a细胞凋亡的作用。2.8 DNA Ladder检测根据琼脂糖凝胶电泳结果可见,正常对照组没有梯状条带(DNA Ladder)出现,DNA无明显弥散,为大片段的基因组DNA；经NNAVC处理后的KG1a细胞有典型的180-200 bp或其整倍数的梯状条带形成。提示NNAVC可以引起KG1a细胞发生DNA片段化,证实其具有诱导凋亡作用。第三章NNAVC对KG1a细胞凋亡相关基因和蛋白表达的影响3.1 NNAVC对KG1a细胞凋亡相关基因mRNA水平表达的影响RT-PCR法检测各组KG1a细胞内凋亡相关基因表达的变化：NNAVC不同浓度组细胞内Bcl-2、Bcl-xL、Bax、Bid、Bad、p53、PUMA、NOXA和NFκB等基因的表达差异有统计学意义(F=5.774,P=0.021；F=20.652,P=0.000；F=9.780,P=0.005；F=6.795,P=0.014；F=18.389,P=0.001；F=246.243,P=0.000；F=10.467,P=0.004；F=7.153,P=0.012；F=47.767,P=0.000)；三种不同浓度NNAVC作用后,Bcl-2基因的表达均有下降,与对照组相比有显著性差异(P=0.035,P=0.004, P=0.028),各药物组之间两两比较差异无显著性(P=0.162,P=0.884,P=0.202)；抑凋亡基因的Bcl-xL在药物作用后表达有所上升,并表现出一定的剂量依赖性,其中0.7μg/ml组和0.8μg/ml组的变化幅度与对照组相比有统计学意义(P=0.001,P=0.000),但两浓度组之间差异无显著性(P=0.202)；在0.7μg/ml组和0.8μg/ml组,促凋亡基因Bax表达水平与对照组相比差异有统计学意义(P=0.003,P=0.018),而各组细胞Bak基因表达差异无统计学意义(F=0.406,P=0.753)；正常KG1a细胞几乎不表达抑癌基因p53,在不同浓度NNAVC作用后,细胞内p53的表达水平均得到显著升高(P=0.000,P=0.000,P=0.000),p53基因相关的PUMA和NOXA两种基因的表达变化无明显趋势；在本实验中检测到,NNAVC 0.6μg/ml组和0.7μg/ml组的NFκB表达水平与对照组相比有所下降,统计有显著性差异(P=0.000,P=0.000)。综上所述,NNAVC对KG1a细胞内各促／抑凋亡基因的表达具有不同的调节作用,提示其发挥作用的机制与凋亡密切相关。3.2 NNAVC对KG1a细胞胞浆内细胞色素C表达影响结果显示,0.7μg/ml组细胞在NNAVC作用0h-12h间,细胞色素C的表达水平呈急速上升状态,之后表达量明显下调；0.8μg/ml组细胞在药物作用0h-6h间,胞浆内细胞色素C的含量呈上升趋势,在药物作用6h-12h间细胞色素C的含量无明显变化,之后表达逐渐下降,至24h时间点,两药物组细胞色素C的表达水平相近,但仍略高于0h时间点。数据分析：NNAVC不同浓度处理与作用时间两因素存在交互效应(F=51.868,P=0.000)；NNAVC不同浓度及作用时间对各组KGla细胞内细胞色素C蛋白含量的影响均有显著性差异(F=82.331,P=0.001；F=552.286,P=0.000)。在两种NNAVC浓度处理时,在不同作用时间点,细胞色素C含量变化组内比较差异有显著性意义(F=316.021,P=0.001；F=278.700,P=0.000)；NNAVC作用6h时间点,0.7μg/ml组细胞色素C含量低于0.8μg/ml组(P=0.018)；在1 2h和18h时间点,0.7μg/m1组细胞色素C含量均明显高于0.8μg/ml组,差异比较有显著性意义(P=0.001；P=0.026)。3.3分光光度法检测Caspase-9蛋白表达分光光度法检测细胞内caspase-9蛋白表达水平的变化：NNAVC不同浓度处理与作用时间两因素存在交互效应(F=23.751,P=0.000)；NNAVC不同浓度处理后KG1a细胞内caspase-9蛋白含量有显著性差异(F=23.982,P=0.001)；作用时间对各组KGla细胞内caspase-9蛋白含量的影响有显著性差异(F=180.774,P=0.000)。在NNAVC作用0h-12h之间,caspase-9蛋白表达水平随作用时间的延长而升高,12h后缓慢下降；NNAVC对KG1a细胞内caspase-9蛋白表达水平的影响同样具有浓度依赖性。结果提示在NNAVC通过激活caspase-9诱导KG1a细胞凋亡。3.4 NNAVC对KG1a细胞表面TRAIL死亡受体和诱骗受体表达的影响死亡受体DR4在不同浓度NNAVC作用后,表达率随着药物浓度的增加而减少,组间比较差异有显著性意义(F=170.107,P=0.000),各浓度组组间两两比较差异有统计学意义(P≤0.005)；死亡受体DR5在0.6μg/ml和0.7μg/ml浓度时表达有所升高,差异与对照组相比有统计学意义(P=0.000；P=0.000)；诱骗受体DcR1在各组细胞的表达率比较差异有显著性意义(F=37.002,P=0.000),0.8μg/ml组的表达率下降与其他两浓度组比较差异有显著性(P=0.000,P=0.000)；诱骗受体DcR2在三种NNAVC浓度作用下,表达率随药物浓度的增加而降低,但与对照组相比,0.6μg/ml组和0.7μg/ml组细胞DcR2的表达率是升高的,差异有统计学意义(P=0.000；P=0.000)。3.5分光光度法检测Caspase-8蛋白表达不同处理后KGla细胞内caspase-8蛋白表达水平的变化显示：NNAVC不同浓度处理与作用时间两因素存在交互效应(F= 51.653, P=0.000); NNAVC不同浓度处理后KG1a细胞内caspase-8蛋白含量有显著性差异(F=47.400,P=0.000)；作用时间对各组KG1a细胞内caspase-8蛋白含量的影响有显著性差异(F=189.867,P=0.000)。各浓度组caspase-8蛋白表达均具有由低到高、再逐渐下降的过程,提示NNAVC可以在短时间内使caspase-8蛋白活化,进而发挥诱导凋亡的效应。3.6 NNAVC对KG1a细胞Caspase-3蛋白表达的影响NNAVC不同浓度处理与作用时间两因素存在交互效应(F=29.694,P=0.000); NNAVC不同浓度处理后KG1a细胞内caspase-3蛋白含量有显著性差异(F=202.507,P=0.000)；作用时间对各组KGla细胞内caspase-3蛋白含量的影响有显著性差异(F=205.361,P=0.000)。在同一NNAVC浓度作用下,细胞内caspase-3蛋白表达呈现低—高—低的趋势,不同时间点差异有显著性意义(F=36.236,P=0.020；F=28.489,P=0.025;F= 175.320,P=0.003); NNAVC分别作用12h和24h时间点时,caspase-3蛋白表达水平随药物浓度的增加而上升,差异比较有统计学意义(F=177.938,P=0.000；F=42.728,P=0.000)。结果提示NNAVC通过激活caspase-3诱导KG1a细胞凋亡,caspase-3蛋白在NNAVC作用6h后就被激活,12h表达量最高,活性升高具有剂量依赖性。第四章NNAVC与活化免疫细胞联合对KG1a细胞的杀伤作用4.1 NNAVC对PBMC和活化免疫细胞的细胞毒作用CCK-8检测结果显示,NNAVC不同作用浓度时,PBMC和活化免疫细胞活性的差异无显著性意义(F=4.025,P=0.062)；不同NNAVC浓度对细胞毒性作用的差异有显著性意义(F=4.629,P=0.016)。NNAVC在(0.5-2.0)μg/ml的浓度范围内对PBMC无明显的毒性作用,差异与对照组相比无统计学意义(F=0.626,P=0.618); NNAVC≤1.0μg/ml时对活化免疫细胞无毒性作用,2.0μg/ml NNAVC作用后活化免疫细胞活性的差异有显著性意义(P=0.003)。提示在1.0μg/ml浓度以下,NNAVC对PBMC和活化免疫细胞均无明显的毒性作用。4.2活化免疫细胞对KG1a细胞的杀伤作用活化免疫细胞在不同效靶比时对诱导杀伤后的KG1A细胞再次杀伤作用比较LDH杀伤检测试剂盒检测结果：活化免疫细胞对各组靶细胞的杀伤活性结果显示,在不同效靶比时,各组靶细胞之间的差异有显著性意义(F=199.354,P=0.000)；细胞杀伤活性均数分别为50.04%、3.95%、36.59%、23.63%、33.27%和8.35%。不同效靶比之间细胞杀伤率比较差异有统计学意义(F=345.299,P=0.000)；除E组外,活化免疫细胞对其余各组靶细胞的杀伤率随着效靶比的升高而增加,在各效靶比作用下,活化免疫细胞对各靶细胞的杀伤活性组间比较差异有显著性意义(F=25.711,P=0.000；F=53.466,P=0.000；F=43.224,P=0.000；F=135.884,P=0.000)。与正常对照组相比,活化免疫细胞对A-E组细胞的杀伤率总体呈下降趋势,提示经过不同来源活化免疫细胞的杀伤作用后,KG1a细胞对活化免疫细胞的敏感性下降。4.3 NNAVC联合活化免疫细胞对KG1a细胞的作用单独应用NNAVC对KG1a细胞的杀伤率为40.61%；单独加入活化免疫细胞,在效靶比为10：1和20：1的情况下,对KG1a细胞的杀伤率分别为34.55%和41.35%,二者比较差异无统计学意义(P=0.414)；NNAVC分别与两种比例的活化免疫细胞联合应用时,对KG1a细胞的杀伤率为56.21%和85.59%,高于这两种干预因素各自单独作用的杀伤率,差异有显著性意义(P=0.018,P=0.000); NNAVC在体系中的作用浓度对两种比例的活化免疫细胞均无明显的细胞毒作用,杀伤率分别为4.35%和1.33%。以上结果提示,NNAVC在对活化免疫细胞无明显毒性作用的浓度时,可以与活化免疫细胞联合杀伤KG1a细胞,作用效果优于二者单独作用,但并未显示二者有协同作用。4.4 NNAVC作用后的KG1a细胞对活化免疫细胞的敏感性LDH释放测定法显示结果显示：活化免疫细胞在不同效靶比间对各组靶细胞杀伤率的差异有显著性意义(F=148.593,P=0.000)；各组靶细胞在两种不同的效靶比的活化免疫细胞作用下,细胞活性间的差异有显著性意义(F=8.721,P=0.001)。在效靶比为10：1的情况下,活化免疫细胞对各组靶细胞的杀伤率组间比较差异有统计学意义(F=12.015,P=0.002)；活化免疫细胞在效靶比为20：1时对各组靶细胞杀伤率组间比较无显著性差异(F=1.177,P=0.337)；各组靶细胞在两种效靶比作用下,组内比较有显著性差异(P=0.003,P=0.010,P=0.010,P=0.001)。以上结果说明,活化免疫细胞对各组靶细胞的杀伤活性随着效靶比的升高而增强,NNAVC作用后的KG1a细胞对活化免疫细胞仍有较强的的杀伤敏感性。4.5 NNAVC联合活化免疫细胞对KG1A细胞体外克隆抑制实验经过不同处理作用后,KG1a细胞接种后7天所形成的克隆情况：两个处理组克隆形成数量的差异组间比较有显著性意义(F=108.614,P=0.000)；不同NNAVC作用浓度之间克隆形成数量的差异有统计学意义(F=270.741,P=0.000); NNAVC浓度与不同处理方法之间有交互效应(F=9.956,P=0.003)。在相同NNAVC浓度作用后,单用NNAVC对KG1a细胞克隆形成能力的抑制作用明显弱于NNAVC与活化免疫细胞联合组,两处理组克隆形成数量比较差异有统计学意义(t=9.141,P=0.001；t=8.273,P=0.001)；经同样处理因素作用后,细胞克隆形成数量随NNAVC浓度的增加而减少,比较差异有统计学意义(F=58.886,P=0.000：F=426.629,P=0.000)。经过不同处理后的KG1a细胞接种后14天形成的克隆数量结果显示：在各药物浓度作用后,两个处理组克隆形成数量的差异有显著性意义(F=26.059,P=0.000)；不同NNAVC浓度间克隆形成数量的差异有统计学意义(F=174.366,P=0.000); NNAVC浓度与不同处理方法之间交互效应无显著性意义(F=2.623,P=0.114)。在相同NNAVC浓度作用后,NNAVC和活化免疫细胞联合作用后细胞形成的克隆数量与NNAVC单独作用后细胞形成的克隆数量比较,差异有显著性意义(t=5.822,P=0.004；t=6.554,P=0.003)；在相同处理条件下,各组细胞克隆形成数量随NNAVC浓度的增加而减少,与对照组相比差异有统计学意义(F=49.972,P=0.000；F=167.300,P=0.000)。NNAVC与活化免疫细胞联合应用后,KG1a细胞形成的克隆数量明显低于NNAVC单独作用组,提示活化免疫细胞可以与NNAVC共同作用杀伤KG1a细胞的克隆形成细胞,使得其克隆数量显著降低。4.6 NNAVC对KG1a细胞表面NKG2D配体表达的影响流式细胞仪检测结果显示：不同处理组细胞表面MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3的表达率组间比较差异有显著性意义(F=3654.504,P=0.000；F=978.748,P=0.000；F=1328.553,P=0.000；F=455.271,P=0.000；F=223.263,P=0.000); 0.6μg/ml的NNAVC作用于KG1a细胞后,ULBP3表达升高,与对照组相比差异有显著性(P=0.003),其余NKG2D配体表达均低于对照组,差异有显著性意义(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000)；0.7μg／ml的NNAVC作用后,KG1a细胞的ULBP1、ULBP2、ULBP3表达增加,差异与对照组相比有统计学意义(P=0.000,P=0.000,P=0.000),MICB表达无明显差异(P=1.000)；0.8μg/ml的NNAVC也可以诱导细胞表面的ULBP1、ULBP2、ULBP3表达增加,与对照组相比差异有统计学意义(P=0.000,P=0.001,P=0.000)；ULBP1-3在三种药物浓度组细胞的表达水平两两比较差异均有显著性(P=0.000)。提示ULBP1-3有可能是NNAVC的调节靶点。结论1. NNAVC能够抑制KG1a细胞增殖自我更新能力,使KG1a细胞的生长周期阻滞于G0/G1期,并诱导细胞凋亡。2. NNAVC能够上调Bax、Bad、p53、NOXA mRNA表达,下调Bcl-2、NF-KBmRNA表达。3. NNAVC促使KG1a细胞线粒体内细胞色素C释放到胞浆中,激活caspase-9,从而激活caspase-3而引起凋亡效应。4.在对KG1a细胞有效浓度范围内,对活化免疫细胞无明显毒性作用。5. NNAVC无法清除的KG1a细胞可以采用活化免疫细胞进行杀伤。6. NNAVC与活化免疫细胞能够联合应用,同时给予或序贯给予均可有效提高对KG1a细胞的杀伤率,有望最大限度地清除AML细胞。7. NNAVC (0.08mg/kg)与活化免疫细胞联合作用能够有效延长hu-Balb/c-nu-KG1a白血病(Balb/c裸鼠荷人KG1a细胞白血病模型)动物的生存期。本研究的创新点首次发现中华眼镜蛇毒组分与活化免疫细胞可以联合应用于急性髓系白血病的治疗研究,并且中华眼镜蛇毒组分在有效杀伤白血病细胞的同时,对活化的免疫细胞无明显毒副作用。研究价值中华眼镜蛇毒组分与活化免疫细胞联合能够更有效地杀伤KG1a细胞,对白血病模型动物具有治疗作用,本研究为临床白血病的治疗、延长患者生存时间提供了新的研究方向。