单粒子跟踪技术是单分子动力学等生物动态过程的重要研究工具之一。通过实现对微纳米尺度微球三维位置纳米级甚至亚纳米级精度的测量,可反映出与之关联的生物大分子折叠与去折叠等生物学信息。目前,微球横向位置的测量已通过Hough变换等方法实现了1nm的测量分辨力,而轴向位置的高分辨力测量一直是微球定位的难点,大多停留在10nm量级的分辨力。同轴数字全息法对成像交叠微球的测量以及离焦成像法高精度测量的特点,使得它们得到了国内外众多研究人员的关注,但仍然存在诸多技术壁垒亟待解决。本文针对微球轴向位置的高精度测量需求,讨论了同轴数字全息法及基于互相关匹配和矢径投影的离焦成像法测量微球轴向位置的思想。主要研究内容可归纳为以下几个方面:1、对基于理论算法匹配及基于实验图像匹配的微球轴向位置测量方法进行了全面系统地描述,包括从测量原理、被测对象特征、测量系统、精度等方面,总结出同轴数字全息法及离焦成像法是目前研究微球轴向位置定位两种最有效的方法之一。2、提出去卷积的同轴数字全息法测量微球轴向位置,重构过程中结合插值拟合等方式,实现了对微球轴向2nm的测量分辨力,并对成像交叠的微球轴向位置有优于5nm的测量分辨力。3、对基于互相关及矢径投影的离焦成像法测量微球轴向位置进行了实验研究。结果表明,该方法对微球轴向位置4分钟内连续定位的测量标准差约为0.64nm,实现了轴向位置最高1nm的测量分辨力,并在同样实验条件下对该方法与同轴数字全息法做了对比测量。