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本文从基因失活、突变体次生代谢产物的分析、基因异源表达、重组蛋白催化特性几方面对安丝菌素后修饰酶Asm25(酰胺N-糖基转移酶)和Asm12(氯代酶)的功能进行了研究。同时还从云南美登木(Maytenus hookeri)的内生放线菌CS中克隆到了一个FADH2依赖型卤化酶并对其体外催化特性进行了研究。
通过基因敲除的方法得到糖基转移酶基因asm25的失活质粒,利用接合转移导入野生型菌株替换野生型的基因得到了突变体。采用LC-ESI-MS分析突变体的产物,对累积的主产物进行分离,并通过MS(质谱)和NMR(核磁共振)对其结构进行了解析。突变体产物分析结果表明,asm25失活后产生了N-去甲基安丝菌素(NDMP-3,N-demethyl-AP-3;NDMP-2,N-demethyl-AP-2)。Asm25基因失活突变体与N-甲基转移酶基因asm10失活的突变体累积相同的主产物NDMP-3,表明酰胺N-甲基化和酰胺N-糖基化是安丝菌素和安丝菌素酰胺N-苷生物合成途径的分枝步骤。通过asm25基因的回补得到回补突变体pJTU813/asm25-5,对其产物进行LC-ESI-MS检测,结果表明基因回补后恢复了其产生安丝菌素酰胺N-苷的能力。
Asm12是安丝菌素生物合成途径中编码卤代酶的基因,通过基因失活证明了它的功能是催化proansmitocin C-19的氯取代反应。克隆asm12基因到pET32a+中,在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)plysS成功表达了C端带有His标签的可溶性蛋白。通过MS和NMR来检测无细胞提取物及纯酶的体外催化活性,结果证明异源表达的Asm12能转化proansmitocin生成19-chloroproansmitocin,但是不能催化L- tryptophan进行氯取代。酶体外催化活性的研究结果也表明,Asm12是FADH2依赖型的卤化酶。以proansmitocin为底物对Asm12的酶促动力学进行了研究,测定了其米氏常数为4.163μM。
云南美登木的内生菌CS产生化合物naphthomycin A,其结构中含一个氯原子,根据FADH2-依赖型卤化酶的保守区设计简并引物从CS的基因组DNA中扩增到了卤代酶的基因片段cshaloA,以该基因片段作探针通过克隆杂交筛选,从CS基因组文库中得到了cshaloA的全长基因。该基因与已经鉴定功能的asm12具有95%的同源性,推断的氨基酸序列含有FADH2依赖型卤化酶的两个保守区。克隆cshaloA全长基因到pET32a+在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中成功表达了C端带有His标签的可溶性蛋白,通过Ni亲和层析得到纯酶进行体外酶活性检测。以proansmitocin为底物,异源表达的CshaloA可以催化其氯取代反应,但是需要FADH2为辅因子。体外酶活性检测证明Csha1oA和Asm12的催化特性相似,都是FADH2依赖型的卤化酶,L-tryptophan不能作为它们的底物。
本文的研究结果为选择性分离安丝菌素的衍生物提供了新的思路,另外酰胺N-糖基转移酶的初步研究也可以为进一步研究提供参考。