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肿瘤组织，作为一个整体，常对化疗产生耐药。其中重要的原因就是细胞间粘附，我们认为信号转导也参与了肿瘤群集耐药的调节，而二者是有一定联系的。本实验从细胞超微结构、蛋白表达等方面探讨了核因子kappa B ( Nuclear Factor kappa B , NF kappa B )信号转导通路在肿瘤群集耐药中的作用机理。首先，利用A549细胞株，建立了两种三维细胞培养的模型(three dimensional cell culture，TDCC )，以CultiSpher为载体的多细胞球形培养(multicellular spheroids，MCS)和无载体支持的三维细胞培养。由于TDCC是有多层细胞结构的细胞培养模型，与单层培养的细胞相比，更接近体内肿瘤组织。与无载体支持的三维细胞培养相比，MCS更有优越性。其优越性至少有以下几点：培养液内单细胞少；细胞球大小、细胞数目比较一致，而且平均单个细胞球上的细胞数量多；细胞间粘附力较强；操作方便。其次，为了探讨粘附导致肿瘤耐药的原因，对MCS培养体系中的细胞与单层细胞培养(monolayer cell culture, MCC)体系中的细胞的超微结构进行了比较。发现，与MCC相比，MCS的细胞有如下特点：细胞间粘附广泛而紧密；细胞间粘附处常有胞膜增厚；部分细胞间可见镶嵌连接；线粒体、内质网丰富。介导细胞间粘附的细胞粘附分子有抗细胞凋亡作用。同时，诱导凋亡是化疗药物杀灭肿瘤细胞的重要机制。提示，MCS细胞间粘附的差异可能是MCS耐药性增强的结构基础之一，抗凋亡可能是其机制。 而且，很多在调节凋亡中起重要作用的蛋白，与线粒体、内质网关系密切。提示，MCS细胞含有比MCC丰富的细胞器，可能是MCS耐药性增强的另一重要的结构基础。接着，检测了MCS与MCC在阻断NF kappa B前后化疗药物敏感性的变化。发现MCS对阿霉素(DOX)的敏感性显著下降。半数抑制浓度(IC50)升高了0.08μg/ml。说明，MCS耐药性与单层培养的细胞有显著性差异，而与体内肿瘤相近，具有群集耐药性。在阻断NF kappa B信号转导通路后，MCS药物敏感性显著升高，IC50下降了0.05μg/ml。而MCC在阻断NF kappa B后，IC50下降了0.02μg/ml。说明，NF kappa B可能是群集耐药的重要原因，抑制其活性可显著提高肿瘤细胞药物敏感性。为进一步研究NF kappa B信号转导通路在群集耐药中的作用，本文分组(MCC空白对照组；MCC加DOX处理组；MCC抑制NF kappa B活性并加DOX处理组；MCS空白对照组；MCS加DOX处理组；MCS抑制NF kappa B活性并加DOX处理组)用<WP=8>electrophoretic mobility shift assay (EMSA)检测了NF kappa B的活性。结果显示，MCS各组的NF kappa B活性都明显高于MCC相应组。结合药敏结果，提示，NF kappa B在群集耐药中起重要作用。结果还显示，在MCC和MCS，加入药物处理后，NF kappa B的活性均明显升高，且以MCS为甚；在加入NF kappa B抑制剂后再加药物处理，与仅加药物处理相比，NF kappa B的活性均明显降低。提示肿瘤细胞在受到化疗药物刺激后，上调NF kappa B的活性，减低药物敏感性；阻断NF kappa B信号转导通路，可增强肿瘤细胞药物敏感性。最后，检测了凋亡、Bcl-xL、Bcl-2和Bax，以进一步研究NF kappa B在群集耐药中的作用机制。发现，阻断NF kappa B后再用药物处理，与仅用药物处理相比，凋亡率明显升高，Bcl-xL、Bcl-2表达量均降低。结合阻断NF kappa B后药敏升高的结果，证明，阻断NF kappa B上调Bcl-xL、Bcl-2抗凋亡的作用，可增强肿瘤细胞药物敏感性。结果还显示，MCS各组Bcl-xL、Bcl-2表达量都明显高于相应的MCC组。而MCS的NF kappa B活性高于MCC，且具有群集耐药性。说明，NF kappa B上调Bcl-xL、Bcl-2抗凋亡是群集耐药重要原因。而在用化疗药物处理后， 在MCC与MCS均可见Bcl-xL、Bcl-2表达量明显升高。结合前面结果，说明：化疗药物作用于细胞后，NF kappa B活性增强，上调Bcl-xL、Bcl-2的表达抗凋亡，降低瘤细胞的药物敏感性，介导群集耐药。本实验还发现，阻断NF kappa B后再用药物处理与仅用化疗药物处理相比，Bcl-2表达量仅轻微下降。其原因可能与Bcl-2受到多种因素(如钙粘附素、白介素)调控有关。而Bax，未加干扰因素时，在MCS组与MCC组，其表达量相近；经化疗药物处理后，表达量升高。由于细胞凋亡与否与抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的比例和结合方式相关。提示MCS的耐药性升高的重要原因是，NF kappa B上调Bcl-xL、Bcl-2的表达，影响抗凋亡蛋白与促凋亡蛋白的比例和/或结合方式，抑制凋亡，导致肿瘤细胞耐药。通过以上的讨论，我们得出以下结论：MCS作为一个由多层细胞构成的整体，能很好地模拟体内实体瘤，具有群集耐药性。其群集耐药的重要原因是NF kappa B活性升高。NF kappa B发挥作用的结构基础可能是细胞间粘附；其机制可能是通过上调Bcl-xL、Bcl-2抗凋亡。阻断NF kappa B信号转导通路，可显著增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。