论文部分内容阅读
背景呼吸道感染是小儿时期最常见的疾病，细菌是其感染的重要致病原。β-内酰胺类抗生素是儿科首选的抗感染治疗药物，在其选择性压力下，细菌产生了超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）。产酶细菌具有多种耐药基因，对多种抗生素产生耐药，不同国家和地区、不同时期，产酶菌株的分布、所含的耐药基因及产生的抗药活性不尽相同。目前，ESBLs菌株所产的酶型已超过700余种，主要包括TEM型、SHV型、CTX-M型及其它少见类型，各型及亚型间酶的耐药性有所差异。自2000年后，CTX-M型酶逐渐替代TEM型、SHV型酶，成为全球流行的主要酶型。对头孢他啶敏感、对头孢噻肟耐药，是产CTX-M型酶细菌的主要耐药特征。如何合理选用抗生素，如何能更有效地检测、治疗产酶菌株的感染、防止其流行，是我们临床上亟待解决的问题。目的1.了解西安地区呼吸道感染患儿产ESBLs细菌总的耐药特征。2.了解西安地区呼吸道感染患儿产ESBLs细菌的耐药基因分布情况。3.通过对流行的主要酶型作原核表达，了解单一酶型产酶菌株的耐药特征，为临床特异性诊断及治疗其感染奠定基础。方法1.对2011.7—2012.10我院住院的呼吸道感染患儿行咽拭子及痰细菌培养，分离获得ESBLs阳性细菌，用K-B纸片扩散法检测其对抗生素的耐药状况。2.设计TEM、SHV、CTX-M-1组、CTX-M-2组、CTX-M-9组基因型引物，PCR方法检测ESBLs细菌的耐药基因分布情况，并通过基因测序获得西安地区现阶段流行的ESBLs耐药基因亚型。3.通过基因重组技术构建原核表达载体，将重组质粒转化入大肠感受态细胞，IPTG诱导表达单一酶型的ESBLs，用K-B纸片扩散法分析其抗药活性。结果1.呼吸道感染患儿中检出产ESBLs细菌共47株，主要为大肠埃希菌26株和肺炎克雷伯菌21株（产酶率分别为52.0%，47.7%）。产酶细菌对头孢类抗生素高度耐药（头孢他啶、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢曲松耐药率为100%），对头孢吡肟部分耐药（耐药率26.9%~38.1%）；对β-内酰胺类抗生素/酶抑制剂复合物耐药率有差异（依次为氨苄西林/舒巴坦38.5%~85.7%、头孢哌酮/舒巴坦19.2%~28.6%、哌拉西林/他唑巴坦7.7~14.3%）；对亚胺培南及美洛培南耐药率为0。2.产ESBLs细菌耐药基因型流行以CTX-M-9组最多见（51.1%），然后依次为TEM型(29.8%)，CTX-M-1组(21.3%)，SHV型(10.6%)，CTX-M-2组检出率为0；DNA基因测序显示CTX-M-9组基因亚型以CTX-M-14为主。3.重组质粒pET32a-CTX-M-14双酶切鉴定显示在5900bp及876bp处各见一目的条带。IPTG诱导BL21-pET32a-CTX-M-14转化菌，SDS-PAGE电泳显示在33KDa附近处见一目的蛋白；重组CTX-M-14型酶大肠埃希菌菌株的抗药活性显示：对头孢噻肟、头孢呋辛、头孢曲松耐药，头孢他啶、头孢吡肟敏感；对酶抑制剂均敏感；对亚胺培南及美洛培南均敏感。结论1.儿童呼吸道感染革兰阴性杆菌产酶严重，主要见于大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌。产ESBLs细菌具有多重耐药的表型特征，对头孢类抗生素高度耐药，对酶抑制剂复合物部分耐药，对碳青霉烯类抗生素尚未发现耐药菌株。2.西安地区呼吸道感染患儿ESBLs细菌对广谱头孢菌素耐药的主要原因是产生了CTX-M-9组耐药基因，其中以CTX-M-14亚型最多见。3.利用基因重组技术成功表达CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶，证实其抗药活性具备CTX-M型产酶菌株的典型特征，为进一步制备单克隆抗体，用免疫学方法早期诊断及特异性治疗CTX-M型产酶菌株的感染奠定基础。