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目的:
以Lewis细胞株为靶向,体外观察转入外源T-bet基因对肿瘤细胞生物学特性和IFN-γ表达的影响,研究转录因子T-bet在抗肿瘤免疫中的作用;体内分析T-bet质粒(pIRES2-mT-bet—EGFP)对Lewis细胞小鼠皮下移植瘤发生发展的影响,探讨应用T-bet改变肿瘤微环境、改善肿瘤机体免疫平衡状态的可能性。
方法:
(1)构建plRES2-mT-bet-EGFP载体,应用脂质体转染的方法[质粒(μg):脂质体(1μl)=1:2]转染Lewis细胞,PCR检测转染前后T-bet,IFN-γ的mRNA表达水平;流式细胞术检测EGFP;ELISA检测分泌的IFN-γ。以PIRES-eGFP质粒作为对照。
(2)将1.5×106 Lewis肺癌细胞接种于小鼠右肩部皮下,制备皮下转移瘤小鼠模型;分三组分别瘤内注射PIRES—eGFP/mT-bet、PIRES-eGFP质粒和PBS。
(3)观察各组小鼠存活时间,肿瘤体积的变化;HE染色观察肿瘤组织的病理改变;Western-Blot检测肿瘤组织T—bet的表达,QRT-PCR检测肿瘤组织T-bet和IFN-γ的mRNA水平。
(4)观察局部引流淋巴结的转移情况,QRT-PCR检测引流淋巴结T-bet和IFN-γ的mRNA的水平。
(5)QRT-PCR检测脾脏T-bet和IFN-γ的mRNA。
结果:
(1)用脂质体成功将T-bet基因转染Lewis细胞,通过对转染前后细胞的研究表明,与对照组相比,T-bet和IFN-γ mRNA及蛋白的表达水平均明显升高。
(2)建立了肺癌的皮下转移瘤小鼠模型,小鼠皮下移植瘤的发病率为100%,发病时间在Lewis细胞注射后6~7天;
(3)瘤内注射pIRES2-mT-bet-EGFP后发现,pIRES2-mT-bet-EGFP干预组小鼠肿瘤生长明显变缓,存活期延长。Western-blot检测结果显示,肿瘤组织T-bet蛋白表达显著高于对照组;QRT-PCR结果显示,肿瘤组织T-bet和IFN-γ的mRNA水平呈上升趋势,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。HE染色组织病理观察可见mT-bet干预组小鼠局部组织淋巴细胞大量浸润。
(4)肿瘤局部注射pIRES2-mT-bet-EGFP明显延缓肿瘤局部引流淋巴结的转移,QRT-PCR结果显示,与对照组相比较,T-bet质粒干预组发生转移的淋巴结T-bet和IFN-γ的mRNA水平呈上升趋势(P<0.05),而脾脏T-bet和IFN-γ的mRNA水平表达没有影响(P>0.05)。
结论:
T-bet基因转染肺癌细胞株(Lewis细胞)可以明显改善IFN-γ的表达。T-bet质粒局部注射可延缓小鼠肺癌Lewis皮下移植瘤的生长,延长小鼠的存活期,增强对已发肿瘤的生长限制作用,并且可以延缓肿瘤局部引流淋巴结的转移,为基因介入的肿瘤生物治疗奠定了基础,为T-bet应用于肿瘤治疗积累试验数据。