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苯并(a)芘[benzo(a)pyrene, B(a)P],又名3,4-苯并芘,由一个苯环和一个芘分子结合而成,是一种广泛存在于人们生产、生活环境中的污染物。1933年,英国学者从煤焦油中分离出苯并芘(B(a)P),并成功诱发出小鼠皮肤癌,使B(a)P成为第一个被发现的环境化学致癌物。动物实验证明,B(a)P对局部或全身都有致癌作用;流行病学研究表明,B(a)P可以通过皮肤、呼吸道、消化道等多种途径被人体吸收,能够诱发皮肤癌,肺癌,直肠癌,胃癌,膀胱癌等。除致癌外,B(a)P还具有致畸,致突变作用,对人体内分泌系统也有一定的干扰作用。1983年国际癌症机构将其确认为环境致癌物。B(a)P虽然被认为是高活性致癌剂,但并非直接致癌物,必须经细胞微粒体中的混合功能氧化酶激活才具有致癌性。B(a)P在体内首先经混合功能氧化酶细胞色素P450酶(CYP1A1)催化在结构弯区形成7,8环氧苯并芘,然后在环氧化物酶和CYP1B1作用下形成7,8二氢二醇苯并芘,该物质经混合功能氧化酶催化,形成二氢二醇环氧苯并(a)芘(BPDE)。BPDE能够与与体内生物大分子如DNA,蛋白质等结合生成共价化合物,被认为是B(a)P在体内的终致癌物。因此随着B(a)P越来越深入的研究,BPDE的致癌性也受到广泛关注,但是具体作用机制尚不明确。BPDE主要与DNA的小沟上的亲核位点鸟嘌呤的环外胺基端共价结合,产生特异突变,形成BPDE-N2-dG。BPDE加合物能够阻止DNA复制,造成复制阻断,复制准确性降低,诱发加合物对应位点上的碱基误渗,最终出现G-T的转变及部分G-A的错误突变,这既是癌变的启动因子,又在癌变发展过程起着关键的作用。B(a)P主要存在于煤焦油、各类碳,石油等燃烧时产生的烟气、汽车尾气中,还有工业废水中及吸烟时香烟产生的烟雾中。另外烧烤和熏制食品也含有大量的B(a)P。因此除了职业暴露外,我们在生活中也会经常接触到B(a)P。鉴于B(a)P对人类的危害性,这几十年来已经有大量的研究报道了B(a)P的终致癌物质BPDE的检测方法,但其绝大部分的研究都是着重于检测BPDE的DNA﹑蛋白加合物或BPDE加合物的水解产物进行定性,定量分析,这些方法前处理步骤繁多致使BPDE加合物的回收率低。因此如果能够选择直接BPDE,不仅简单易行,可以提供个体“内接触”量或“有效接触”量,还能提供化学毒物的代谢活化信息。在本研究中,采用高效液相色谱-紫外检测和荧光检测法对BPDE标准品溶液及细胞液中的BPDE进行检测,为进一步研究BPDE的定性和定量分析奠定基础;用单细胞凝胶电泳方法检测了BPDE对体外培养的HepG2细胞的DNA损伤,以期反映BPDE对遗传物质的损伤;最后是对B(a)P的原型消减进行探索性研究,用B(a)P单独染毒或B(a)P与PCB153联合染毒HepG2细胞,然后用HPLC-UVD﹑FD检测经HepG2细胞代谢后细胞中的B(a)P的浓度,探索PCB153在B(a)P代谢过程中的作用。第一部分B(a)P代谢产物BPDE的检测技术1. B(a)P代谢产物BPDE的HPLC-紫外检测技术采用高效液相色谱-紫外测定的方法检测BPDE标准品溶液及在细胞液中的BPDE。结果发现:BPDE标准品在DMSO溶液中的浓度与其峰面积呈现出良好的线性关系,其线性回归方程为Y=637138X-124587,R2=0.9982。BPDE标准品在浓度1.00～20.00μg/ml范围内具有良好的线性关系,该方法的最低检出限为0.0625μg/ml。BPDE标准品在细胞裂解液中的线性回归方程为Y=424298X+24598,R2=0.9921。本方法的日内精密度RSD 2.9～3.6%和日间精密度RSD 4.3～5.9%。BPDE化学性质极不稳定,对光,湿度及酸很敏感。在同样的浓度下,BPDE标准品和细胞裂解液中的BPDE标准品的峰面积出现差异,经过分析,在细胞裂解液中的BPDE的含量偏低,但显著高于在环境中的自然变化。2. B(a)P代谢产物BPDE的HPLC-荧光检测技术采用高效液相色谱-荧光测定方法检测BPDE标准品溶液及在细胞液中的BPDE。结果发现:BPDE标准品在DMSO溶液中的浓度与其峰面积呈现出良好的线性关系,其线性回归方程为Y=2E+07X+178569,R2=0.9988。BPDE标准品在浓度0.01～1.00μg/ml范围时具有良好的线性关系,该方法的最低检出限为0.005μg/ml。本方法的日内精密度RSD 3.2～4.6%和日间精密度RSD 5.9～7.4%。在同样的浓度下,BPDE标准品和细胞裂解液中的BPDE标准品的峰面积出现差异,经过分析,在细胞裂解液中的BPDE的含量偏低,但显著高于在环境中的自然变化。第二部分BPDE致HepG2细胞DNA损伤的毒理学研究用0.05μmol/L,0.1μmol/L,0.5μmol/L,1μmol/L,2μmol/L5个不同浓度的BPDE染毒体外培养的HepG2细胞,用50μmol/LB(a)P做阳性对照,采用单细胞凝胶电泳的方法检测BPDE对HepG2细胞的DNA损伤。结果显示,在本实验中不同浓度的BPDE染毒组与正常组相比Olive尾矩均有显著性差异(P<0.01),而不同浓度组之间差异也有显著性(P<0.01),BPDE最高浓度组与B(a)P阳性对照组相比也有显著性差异(P<0.01),随着BPDE浓度的增加,HepG2细胞的Olive尾矩值逐渐增大,并呈明显的剂量-依赖关系。这说明反式BPDE可引起DNA断裂损伤,且损伤程度与染毒剂量有关。第三部分苯并(a)芘原型代谢消减的探索性研究用50μmol/L B(a)P对HepG2细胞单独作用72个小时或先用不同浓度(0.1μmol/L, 1μmol/L,10μmol/L,100μmol/L)PCB153对HepG2细胞预处理48个小时然后再与50μmol/L B(a)P联合作用24个小时,采用HPLC-UVD﹑FD检测HepG2细胞内经过代谢后的B(a)P的浓度。结果显示,PCB153在低浓度0.1μmol/L和1μmol/L与B(a)P联合作用时,在HepG2细胞内检测到的B(a)P浓度要高于B(a)P单独作用的浓度,且随着PCB153浓度的增高,在HepG2细胞内检测到的B(a)P浓度有增高的趋势。但是在PCB153的浓度为10μmol/L和100μmol/L时,它与B(a)P的联合作用后在HepG2细胞内检测到的B(a)P浓度要低于B(a)P单独作用的浓度,且随着PCB153浓度的增高,在HepG2细胞内检测到的B(a)P浓度呈现出降低的趋势。由此我们推测PCB153在诱导P450酶活性时可能存在一定的浓度范围,在浓度10μmol/L～100μmol/L PCB153可以增强P450酶活性,从而可以进一步促进B(a)P在细胞内的代谢,低于此范围则可能不会增强P450酶活性。