论文部分内容阅读
背景:Transgelin基因位于人类11号染色体,主要在平滑肌细胞及非肌细胞中表达[1,2],已有相关资料[3]提示Transgelin基因可能以多种形式参与到肿瘤的发生过程,可能是一种新的抑癌基因。Transgelin-2为Transgelin的同系物,Transgelin-2既表达于平滑肌细胞中,也表达于胰腺、骨髓等非平滑肌细胞中[4.5]。Transgelin-2基因所表达的蛋白被称作肌动蛋白结合蛋白,是一种重要且具有代表性的肌动蛋白结合蛋白。从结构上看,Transgelin-2蛋白具有Calponin蛋白家族重要成员之一Calponin蛋白的特性,蛋白分子结构主要由氨基末端的CH结构域(calponin homology domain)和羧基末端calponin样重复模体(calponin-like repeat,CLR)的单拷贝或者多拷贝的串联重复序列组成[6],基本功能是和肌动蛋白结合,从而参与细胞骨架重构和调整[7,8],可能参与肿瘤细胞的转移。Transgelin-2蛋白的功能一直被认为是对肿瘤细胞有抑制其转移的作用,目前根据GeneCards数据库和相关文献查明Transgelin-2具体生物学功能及作用机制尚不明确[9]。Transgelin-2有可能是具有完整TAGLN或其片段(在组织或生物流体诸如血清或尿测得),可以作为一个肿瘤学“体温表”(即定点诊断标志物),用于检测侵入性恶性疾病的存在,类似于使用的C-反应蛋白(CRP)或用于检测炎性状态的红细胞沉降率(ESR)[10]。Transgelin-2蛋白有望可以作为恶性肿瘤侵袭、转移检测的指标之一,为临床鉴别肿瘤恶性程度及预后提供参考指标及治疗靶点。通过在线生物信息学基因蛋白相互作用检索工具STRING对Transgelin-2潜在的直接或着间接相互作用蛋白进行搜索和预测,已经发现了几种可能和Transgelin-2存在相互作用关系的蛋白,这三种蛋白分别是:蛋白β-Actin(ACTB)、周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)和细丝蛋白A(FLNA)等[11]。发现人类癌症组织中的特异性生物标记物,对相关癌症的早期诊断和疾病的分子认识至关重要,Transgelin-2与癌症的发生和转移的关系正在受到人们的密切关注,Transgelin-2在肿瘤发生、发展和转移中的作用为肿瘤的诊断和治疗提供了新的思路。相关研究中表明[9,12-16],Transgelin-2蛋白被认为参与了多种恶性肿瘤的发生、发展过程,并可能是特异性肿瘤标志物,将为进一步揭示Transgelin-2的生物学功能提供新的线索和依据。目的:本研究通过研究发现与Transgelin-2蛋白相互作用的蛋白,进一步阐述Transgelin-2蛋白的功能,认识与理解肿瘤细胞如何在人体内发挥作用的生命过程,为进一步研究Transgelin-2蛋白作用机制提供新的线索。体外pull-down实验是研究蛋白质之间相互作用的重要技术,通过体外pull-down发现与Transgelin-2相互作用的蛋白,为进一步研究Transgelin-2在抑制肿瘤生长、转移方面寻找证据及突破口,期望为肿瘤的早期诊断、治疗指导和监测治疗以及抗肿瘤药物的研发提供证据。方法:从食管癌细胞NE3中提取人类全组RNA,经过反转录、PCR、电泳得到目的基因Trangelin-2的DNA克隆片段,连接T载体构建克隆载体T-Transgelin-2并测序正确后,构建原核表达质粒pGEX-6P-1-Transgelin-2,用IPTG进行蛋白诱导表达,确认诱导蛋白表达后,进行GST-Transgelin-2蛋白的纯化。准备多种肿瘤细胞并培养,利用体外pull-down技术筛选出Transgelin-2与之发生作用的肿瘤细胞并用质谱分析检测该肿瘤细胞的与Transgelin-2蛋白相互作用的蛋白。结果:(1)成功从食管癌NE3细胞中提取人类全组RNA,反转录、PCR后得到目的基因Transgelin-2(2)构建pGEX-6P-1-Transgelin-2原核表达质粒(3)经IPTG诱导GST-Transgelin-2融合蛋白表达(4)GST-Transgelin-2融合蛋白在细胞上清中表达并被成功纯化(3)通过体外pull-down实验及质谱分析鉴定得到与Transgelin-2蛋白作用的蛋白。结论:(1)Transgelin-2蛋白在原核细胞中得到可溶性表达并被成功纯化。(2)Transgelin-2蛋白与肌球蛋白重链9(myosin-9)、非常规肌球蛋白IC(Unconventional myosin-IC)存在相互物理结合,为进一步研究Transgelin-2的生物学功能打下基础。