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由单胞锈菌(Uromyces setariae-italicae)引起的谷子锈病是威胁谷子生产安全的重要病害之一,常造成严重经济损失。选育并合理利用抗病品种是减轻锈病最经济、有效、安全的方法。同时,抗病基因的研究也是抗病育种的基础,克隆谷子抗锈或抗锈相关基因不仅可以加快抗病育种工作,而且有助于揭示谷子抗锈机理,为开发快速、高效的防治技术提供理论依据。本研究以谷子抗锈/感锈病材料及其杂交的F2代群体为材料,对谷子抗锈基因连锁的分子标记及抗病相关基因的克隆等方面进行了研究,为谷子抗锈基因的分子鉴定、辅助选择及抗病机制相关研究奠定基础。本论文内容包括以下几方面:1.应用AFLP标记技术筛选获得了10对能够揭示抗感材料之间多态性的AFLP引物组合;应用所获得的AFLP引物组合对谷子抗锈/感锈病材料及其F2代群体中的抗感基因池进行扩增,获得了18个抗锈材料中特有的差异条带;生物信息学分析结果表明,2个差异条带与玉米的W22 pol基因和水稻的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶基因的同源性分别为86%和92%,其他差异条带未发现同源的基因,推测可能为新的基因。2.根据差异条带的测序结果设计PCR特异引物,成功地将AFLP标记“E+GC/M+TC”转化为结果稳定、操作简单的SCAR标记“SCEM-187”。以转化成功的SCAR标记对抗锈基因进行定位,结果表明标记“SCEM-187”与谷子抗锈基因间的遗传距离为27.4 cM。3.应用RGA技术对谷子基因组DNA和cDNA进行扩增,获得了7个抗病材料十里香中特异的NBS类型抗病基因同源序列。NBS类型抗病基因同源序列均含有P-loop和Kinase 2α结构域,与水稻含有的NB-ARC保守结构域的蛋白、水稻和玉米的NBS-LRR类型抗病蛋白、小麦的抗病蛋白等的同源性分别在47%～98%之间。聚类分析结果表明,7个RGA片段分为三类:第一类包括RUS1-1、RUS1-2、RUS1-3和RUS1-6,与水稻Pib基因聚在一起,属于NBS-LRR类型抗病基因;第二类包括RUS1-5和RUS1,与LZ-NBS-LRR类型的拟南芥RPP8和HRT基因聚在一起;第三类包括RUS1-4,与番茄NBS-LRR类型I2基因聚在一起。4.根据番茄Fen和水稻Xa21等蛋白激酶基因保守结构域设计引物,从抗病材料十里香中获得了1个STK类型抗病基因同源序列。BLASTX分析结果表明,STK类型抗病基因同源序列与水稻中推测的丝氨酸/苏氨酸受体激酶PR5K、小麦LRK33和抗锈激酶Lr10同源性在77%～78%之间。5.根据已知的RUS1序列,利用Genome Walking和Reverse PCR技术获得了RUS1的全长DNA(GenBank登录号:FJ467296)和cDNA序列。DNA全长2673 bp,cDNA为2193 bp,编码731个氨基酸,含有3个外显子和2个内含子。RUS1基因编码产物分子量为82.588 kD,等电点(pI)为8.20。半定量RT-PCR分析结果表明,谷子NBS类型抗病基因同源序列RUS1表达方式为组成型表达。随着接菌时间的延长,RUS1表达量增加,参与谷子抗锈病反应。6.生物信息学分析确定了RUS1基因具有NBS、LRR、HD等一系列植物抗病基因的保守结构域,且与NBS-LRR类抗病Pib、HRT和RPP8的亲缘关系较近。确定了RUS1基因属于NBS-LRR类型的抗病基因。RUS1蛋白的二级结构以α-螺旋为主,其次为无规线团;RUS1基因与大麦NBS-LRR类型抗病蛋白同源性为58%,与水稻含有NB-ARC结构域的蛋白同源性为63%,与小麦的抗病蛋白同源性为59%。7. Southern杂交结果表明,RUS1以多拷贝形式存在于谷子十里香基因组DNA中。8.根据已知的RUS1基因序列,利用Genome Walking技术获得了RUS1基因的启动子序列,长度为675 bp。成功构建了RUS1∷GUS双元载体。GUS染色结果表明,含有双元载体RUS1∷GUS的农杆菌经染色后溶液变蓝,表明该启动子具有活性。9.通过PCR扩增获得含有启动子序列的RUS1基因。成功构建了植物表达载体p1300∶RUS1。10.利用SSH技术对抗锈病材料十里香接种锈菌后诱导基因的表达情况进行了研究,共获得了11个诱导表达的序列。BLASTX分析结果表明,1个序列与小麦、大麦和水稻的SGT1和水稻、玉米的skp1等位基因g2抑制因子的同源性在91%～97%之间;4个序列未发现同源的序列,可能为新的基因;其他序列与水稻保守的假定蛋白、葡萄未知蛋白、水稻和玉米光合系统I亚基IX、玉米未命名蛋白和核糖体蛋白S14的同源性在58%～96%之间。