骨肉瘤(Osteosarcoma)是最常见的恶性骨原发性肿瘤之一.骨肉瘤的恶性程度很高,发现时往往已发生转移,其中多为肺转移,死亡率高,严重影响着青少年患者的预后。因此了解骨肉瘤分子生物学特性,探讨新的生物靶点可以帮助我们进一步探讨骨恶性肿瘤的生物学行为,为骨恶性肿瘤的个体化治疗提供方向和依据,同时对患者生存率的提高非常有帮助。SNAT1是Na+偶联的中性氨基酸转运蛋白,主要介导小分子物质例如谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺。其主要分布在大脑和脊髓的神经元中,在肝脏、肾脏、脾脏等其他实质性脏器官未见分布。目前研究发现,SNAT1在几种恶性肿瘤的瘤体中呈过表达,提示SNAT1作为恶性肿瘤危险因素而独立存在。但目前SNAT1在恶性肿瘤研究报道较少,其在肿瘤细胞的生理功能、生物学特征、与肿瘤转移相关性、基因表达的调节等机理等方面的作用仍较模糊。而且到目前为止国内外尚未见于SNAT1在骨肉瘤中的实验研究报道。本课题将主要研究SNAT1在骨肉瘤组织中的蛋白表达水平,以及与临床病例资料之间的关系。同时从体内外研究SNAT1基因沉默对骨肉瘤细胞生物学行为的影响及其可能的产生机理。期待通过本实验的研究,探讨SNAT1作为一种新的骨肉瘤预后判断指标及转移标志物的可能性,同时为骨肉瘤的临床生物治疗提供一个新的靶点。第一部分人骨肉瘤组织中SNAT1的表达及其临床意义目的：研究人骨肉瘤中SNAT1的表达情况及其与临床病理的相关性,初步探讨SNAT1在人骨肉瘤组织中所表达的生物学意义。方法：随机选取2006年1月～2009年12月在上海市长征医院与上海市长海医院进行手术切除并经病理诊断证实为骨肉瘤患者的组织样本40例、骨软骨瘤10例,结合临床病理资料对实验结果统计分析并从蛋白水平运用免疫组化等实验技术来检测SNAT1的表达以探讨SNAT1在人骨肉瘤中表达的临床意义。结果：(1)骨肉瘤组织中SNAT1蛋白表达强度和表达率较在骨软骨瘤中明显升高。SNAT1在骨肉瘤原发灶组织中表达阳性率为85%(34/40),而骨软骨瘤组织中表达阳性率仅为40%。(2)SNAT1在骨肉瘤中的表达与骨肉瘤的远处转移以及预后存在相关性,而与肿瘤的大小,年龄、性别均无相关性。(3)SNAT1的表达与患者的生存期呈负相关,SNAT1高表达的骨肉瘤患者预后较SNAT1低表达的患者明显较差,且SNAT1与远处转移等因素一样,成为影响骨肉瘤患者的独立预后因素之一。结论：SNAT1基因的表达与骨肉瘤的复发转移和患者的预后差具有相关性。骨肉瘤患者高表达SNAT1,其生存率明显降低。SNAT1的过表达提示骨肉瘤患者的预后较差。SANT1的表达可能与骨肉瘤的恶性生物学行为相关。第二部分SNAT1在骨肉瘤细胞增殖中的作用研究目的：探讨SNAT1的表达对骨肉瘤细胞增殖能力的影响。方法：1、设计特异性靶向SNAT1的shRNA序列并克隆至慢病毒载体,通过酶切和测序确定包含正确序列的克隆。于293T细胞中完成包装获得慢病毒上清。将慢病毒感染骨肉瘤细胞MG-63-2,荧光显微镜确定感染效率。2、成功构建shSNAT1和对照shNon表达的骨肉瘤细胞MG-63-2,利用Realtime-PCR和Western blotting确定shRNA对目的基因SNAT1的干扰表达效果,为下一步细胞水平实验和动物实验奠定基础。3、通过MTT法检钡shSNAT1对骨肉瘤细胞株MG-63-2的增殖能力的影响。结果：1、成功构建特异性靶向SNAT1的shRNA慢病毒表达载体,可有效下调细胞中SNAT1的表达。2、SNAT1的表达下调可显著抑制骨肉瘤细胞的增殖能力,表明SNAT1具有促进肿瘤细胞增殖的作用。结论：通过shRNA下调骨肉瘤细胞中SNAT1的表达可以抑制肿瘤细胞的增殖,提示SNAT1在骨肉瘤中可作为一种癌基因发挥促进肿瘤细胞增殖的作用。第三部分SNATl在骨肉瘤细胞动物体内成瘤中的作用目的：探讨SNAT1对人骨肉瘤细胞在裸鼠体内成瘤的影响。方法：将shSNAT1和shNon稳定表达的骨肉瘤细胞MG-63-2分别接种裸鼠,记录肿瘤的生长,在终末期处死裸鼠,取瘤体进行免疫组化分析。结果：1、shSNAT1组骨肉瘤细胞在裸鼠皮下成瘤速度慢于shNon细胞组,形成的肿瘤较小。终末期处死小鼠后,观察发现与对照细胞相比,shSNAT1转染细胞体内成瘤的体积明显减小。2、免疫组化结果显示SNAT1的表达下调对裸鼠体内成瘤有抑制作用；SNAT1对骨肉瘤的发生发展及转移中的作用可能与多条通路相关。结论：通过裸鼠体内成瘤实验发现SNAT1的表达下调可抑制骨肉瘤细胞的体内成瘤作用,提示SNAT1对骨肉瘤的发生发展具有重要的作用,并可能与多条通路相关。SNAT1有望作为靶基因用于临床上骨肉瘤的分子诊断和基因靶向治疗