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极端嗜热古菌-硫化叶菌的蛋白存在广泛的赖氨酸甲基化修饰。本实验室先前发现,硫化叶菌染色质蛋白Cren7存在不同程度的甲基化修饰。但是,负责这种修饰的酶一直未被发现。本研究以重组Cren7为底物,采用基于活性跟踪的生化分离方法及质谱鉴定手段,从冰岛硫化叶菌中分离得到了泉古菌界中第一个蛋白质赖氨酸甲基转移酶,并将该酶命名为aKMT。aKMT在泉古菌界高度保守,其相似性较低的同源蛋白或序列还存在于部分细菌和真核生物中。主要研究内容包括: ⑴aKMT的分子质量为18 kDa,在溶液中以单体形式存在。该酶在较宽的温度范围(25℃-90℃)内均表现出活性,最适反应温度为60-70℃;其甲基转移活性不依赖于二价阳离子,受高盐浓度抑制。aKMT在体外不仅能够修饰重组Cren7,还能够修饰多个重组的硫化叶菌蛋白,表现出宽泛的底物特异性。 ⑵对aKMT与S-腺苷基甲硫氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)复合物的结构分析显示,该酶具有经典的开放α/β结构。该结构由5个α螺旋和β折叠交替形成,C末端为2个β折叠。aKMT的氨基酸残基Thr12、Asp34、Gly36、Glu59、Asn87和Phe88与SAM通过氢键发生相互作用,Val10、Pro11、Phe102等氨基酸残基与SAM存在疏水相互作用。氨基酸6-HVPYVP-11以及102-FLLTNVNE-109位于SAM口袋周围,对这两段序列中的氨基酸残基进行丙氨酸扫描后发现,T105、N106、V107的突变对活性几乎没有影响;H6、P8、E109突变后活性相当于野生型的~70%; V7、V10突变后活性尚存40-50%; Y9、P11、F102、L103、L104、N108的突变使活性丧失80-90%。 ⑶利用同源重组的方法,构建了冰岛硫化叶菌aKMT基因缺失突变体菌株。菌株能够存活,说明aKMT不是必需蛋白。缺失突变体菌株与野生型菌株在测试的培养条件下生长表型表现出一定差异,在营养较差的PSACVY培养基中、于65℃生长时,二者生长差异最明显。测定了野生型与突变株的细胞内蛋白的热稳定性,采用DSC方法测定时二者的Tm相差~5℃,在其他条件下未检测到明显的差异。 ⑷对野生型及突变体菌株细胞蛋白的赖氨酸甲基化修饰状态进行了质谱分析,发现在检测到的1423个野生型菌株细胞蛋白中,520个发生了甲基化修饰;而在突变体菌株中,1450个检测到的蛋白中有109个被甲基化修饰。生物信息学分析表明,aKMT修饰的底物包括在复制、转录、翻译、蛋白质折叠、翻译后修饰以及碳水化合物、氨基酸、核苷酸、脂质的运输与代谢等过程中起作用的蛋白;修饰位点侧翼序列未表现出可检测的氨基酸残基或性质的偏好性。 ⑸aKMT是硫化叶菌中的一种主要的蛋白质赖氨酸甲基转移酶,其保守性提示该酶对于这类极端嗜热微生物生理学的重要性,但该酶的功能尚有待进一步研究。