附子（Aconiti Lateralis Radix Praeparata）为植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的子根的加工品,具有强心、抗心律失常、抗炎镇痛、抗肿瘤等多种药理活性,同时具有心血管系统和神经系统毒性,其主要毒性及活性成分为二萜生物碱。2020版《中国药典》收载了黑顺片、白附片、炮附片、淡附片等4种可直接用于临床的炮制品,其余各地方炮制规范收载有十余种不同炮制品。然而附子化学物质基础及不同炮制条件下毒性和活性成分含量动态变化的炮制减毒机理仍有待进一步深入探索及完善,不同炮制品由于炮制工艺不同及不稳定等原因,它们之间化学成分的种类及含量差异不够明晰,也缺少能全面监测不同类型化学成分相对含量的质量评价和质量控制方法。针对以上问题,本论文基于液相色谱-质谱联用技术,通过化学成分分离及高效、灵敏的靶向表征方法系统阐明了附子的化学物质基础;建立了多成分定量分析方法和拟靶向代谢组学分析方法实现对附子不同炮制品的分析比较及质量评价;从化学及药理层面揭示并验证了附子的炮制减毒机理并对炮制工艺进行进一步优化。具体的研究内容主要包括:1.附子化学成分及抗肿瘤活性研究通过检索植化分离文献,构建了基于Compound Discoverer软件的附子已知二萜生物碱数据库,收录2022年前从植物Aconitum carmichaelii Debx.中分离的160个二萜生物碱信息。基于LC-MS技术,指认了附子中不同类型二萜生物碱目标化合物。综合运用柱色谱法、高速逆流色谱法以及半合成等多种方法,从附子中共得到46个单体化合物;并采用HR-ESI-MS、1D和2D NMR等波谱技术进行结构鉴定,共鉴定出43个不同结构类型二萜生物碱,其中4个新化合物,包括第一个报道的以C20型二萜生物碱为骨架的生物碱糖苷类化合物。对其中的37个二萜生物碱化合物进行体外抗肿瘤活性系统评价,并讨论了C19二萜生物碱的抗肿瘤活性构效关系,发现C-8位、C-10位、C-14位和氮原子等活性位点。2.附子二萜生物碱靶向表征研究通过线性离子阱-静电场轨道阱（LTQ-Orbitrap）质谱的CID裂解模式获取已分离的43个不同结构类型二萜生物碱的MSn（n=2,3,4）质谱碎片,并总结质谱裂解规律。构建了基于超高效合相色谱（UPC~2）和反相色谱（RP）的离线二维色谱分离系统,经评价正交性良好,能通过两种不同的正交分离机制更全面地揭示附子中的二萜生物碱类成分,尤其是微量共流出成分及同分异构体等。根据分子设计原理构建了基于Compound Discoverer软件的二萜生物碱预测数据库,并采用质量亏损过滤技术得到了特异性母离子列表,用于二萜生物碱的靶向数据采集。建立综合分析策略,通过母离子列表、动态排除等质谱数据采集方法,以及元素组成分析、不饱和度分析、诊断离子过滤、中性丢失过滤、数据库匹配等数据后处理方法,对附子中二萜生物碱成分进行系统表征,共表征了659个成分,其中526个可能为附子中潜在的新化合物。3.附子不同炮制品的分析比较及质量评价研究采用三重四级杆质谱的动态MRM模式,建立了15个关键成分的定量分析方法,方法学验证结果表明专属性、线性、重复性、精密度、稳定性良好,回收率符合要求,并对附子不同炮制品进行了绝对定量分析及比较研究。建立了可同时监测324个离子对的拟靶向代谢组学分析方法对附子不同炮制品中不同类型化学成分进行了半定量分析及比较研究,方法学验证结果表明建立的拟靶向代谢组学分析方法具有良好的线性、重复性和稳定性,并结合主成分分析、正交偏最小二乘判别分析、聚类热图等多元统计分析方法筛选出多个含量显著升高或降低的差异性化学成分,通过绝对定量分析结果进一步验证了其化学成分的差异性。4.附子炮制减毒机理及炮制工艺研究系统考察并确认了附子炮制过程中的煮制时间、蒸制压力及时间、溶液p H值等不同因素对双酯型二萜生物碱、单酯型二萜生物碱、胺醇型二萜生物碱等化学成分的含量均能产生较大影响;制备了附子不同化学部位,并对其急性毒性和强心活性进行初步评价,结果表明双酯型二萜生物碱为附子中主要的毒性成分,而强心活性可能由多种成分共同发挥作用,分别从化学及药理层面揭示并验证了附子的炮制减毒机理为毒性较强的双酯型二萜生物碱分解为毒性降低而活性保留的单酯型二萜生物碱及胺醇型二萜生物碱等。依据附子炮制减毒机理,在传统炮制工艺的基础上,通过将煮制时间延长至3 h以上、使用p H12的饱和Ca（OH）2溶液或在70 k Pa高压下蒸制2 h以上等方法对附子炮制工艺进行了进一步优化,得到的炮制品均可使毒性较强的双酯型二萜生物碱含量降低10-100倍。此外,通过计算3个主要的双酯型二萜生物碱和单酯型二萜生物碱的相对含量（ADA/MDA）,以及3个胺醇型二萜生物碱和单酯型二萜生物碱的相对含量（DDA/MDA）,并以炮制程度作为判断指标,对多批次附子配方颗粒及中成药进行了综合质量评价,结果表明附子配方颗粒可能具有较低毒性,适合临床使用;多数附子中成药的ADA/MDA和DDA/MDA范围分别为4.44-22.79%和0.09-24.86%,质量一致性较好。综上,本论文基于液质联用技术,通过对附子二萜生物碱成分的靶向分离和质谱表征阐明了附子的化学物质基础;系统考察了附子不同炮制因素对化学成分变化的影响并制备了附子不同化学部位进行活性和毒性评价,分别从化学及药理层面揭示并验证了附子的炮制减毒机理并进一步优化了附子炮制工艺;建立了15个关键成分的定量分析方法以及同时监测324个离子对的拟靶向代谢组学分析方法用于附子饮片及复方的综合质量评价及质量控制。本论文开发的多种高灵敏度及高选择性的质谱分析方法为中药复杂体系化学物质基础的阐释及质量评价方法的建立提供了有益参考。