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研究表明SmpB蛋白参与细胞众多生理过程的调节,如机体新陈代谢、脂多糖生物合成、脂肪酸代谢途径、致病菌入侵宿主等,其参与的调控作用对于细菌蛋白质合成质量控制、致病菌中毒力系统调控、维持机体正常生长及发育等过程具有关键作用。 本论文以致病菌维氏气单胞菌作为实验模式菌,对其SmpB蛋白调节双组份系统毒力传感蛋白BvgS启动子现象与机制进行探索,取得了以下结果: 1、使用增强型绿色荧光蛋白(eGFP)作为报告基因,与BvgS启动子融合构建载体 pDH114,同时构建表达维氏气单胞菌 SmpB的质粒,将其共转化到△tmRNA△SmpB E.coli Feldon中,通过测定Flu/OD600值的强弱来表征BvgS表达量的变化。结果表明维氏气单胞菌SmpB蛋白对BvgS启动子具有正调控作用。 2、进一步利用维氏气单胞菌SmpB蛋白截短突变体△N34和△C30以及定点突变体G11S12→A11A12,T14I15→A14A15,F26I27→A26A27,E32A33G34→A32A33A34, G133K134→A133A134,D138K139R140→A138A139A140,K152→P152,探究影响其功能的关键区域与关键位点。结果发现N端区域对于SmpB发挥功能很关键,C端区域可以影响SmpB功能;G11S12及E32A33G34位点对于SmpB发挥功能比较重要。 3、通过构建 pET-28a(+)-SmpB-His6表达载体、IPTG诱导表达、Ni-琼脂糖凝胶6FF纯化、Western Blot检测,获得纯化的SmpB蛋白,与BvgS启动子进行琼脂糖凝胶迁移实验。结果显示SmpB/BvgS启动子存在滞后现象,表明SmpB蛋白与BvgS启动子可以特异性的相互作用。 4、通过基因敲除获得维氏气单胞菌△SmpB和△tmRNA突变株,利用实时定量 PCR技术分别对E.coli Feldon模式菌中BvgS启动子下 eGFP转录本及△SmpB和△tmRNA突变株中BvgS基因转录本进行检测。结果表明在细菌生长稳定时期,SmpB蛋白通过影响 BvgS启动子转录水平来调控下游基因表达, tmRNA对BvgS转录水平影响不大。 综上所述,本论文初步阐明了维氏气单胞菌SmpB可以正调控双组份系统毒力传感蛋白BvgS启动子现象与机制,对发掘细菌性疾病治疗靶点,研发新型抗生素提供了新的方向和思路。