研究背景糖尿病(DM)作为一种以血糖浓度增高、胰岛素缺乏或作用下降为主要特征的慢性疾病已成为严重的社会经济问题,其中2型糖尿病是发病率最高也是危险性最高的一类,通过膳食防治糖尿病已成为社会广泛共识,相应地有关食品调节血糖的功能学研究得以发展。为了探索DM的发病机理、天然食品调节血糖的作用机制及评价等问题,建立能够模拟人类疾病特征的实验动物模型也备受关注。至目前为止用作糖尿病相关研究的动物模型包括手术型、诱导型、自发型、转基因型等。由于2型糖尿病或胰岛素抵抗与糖脂代谢密切相关,肥胖和高能量膳食摄入可增加其发病风险,高脂高糖膳食诱导肥胖型的高血糖动物模型以及在此基础上联合小剂量链脲佐菌素的造模方法因符合人类生存环境及胰岛素发病机理而愈来愈多地被加以应用。但是由于此模型缺少统一的操作手段,对主要影响因素的作用贡献不清,使得不同的造模手法可产生不同的病理生理改变,由此为解释、评价和横向比较食品功能的意义带来困难。为了解不同膳食条件下诱导模型的优势,本研究着重对高脂高糖膳食诱导高血糖动物模型及其影响因素展开了研究。研究目的1.分析和探讨正常大鼠血糖相关基础数据及其影响因素2.确定诱发高血糖动物模型的膳食关键因素及配方3.确定膳食及化学损伤的作用关系及模型特点4.探讨动物模型的实用价值和复现性5.为科学研究和政府需求提供科学依据材料与方法1.正常大鼠血糖水平分布及其影响因素按照严格的入选原则对5年研究中所测定正常Wistar大鼠和SD大鼠空腹血糖和OGTT后2h的血糖测定数据的分布进行统计,分析影响血糖的主要因素；然后采用对比实验设计,对血源(静脉血、动脉血)、血样采集时间(餐后5h、11h)、样品处理时间(立即、30-60min、60-120min、>120mmin)和测试方法(GOD法、血糖仪法)等因素的影响进行估算,并以此对血糖分布进行校核,提出正常大鼠分布上限。2、高脂高糖饲料诱导胰岛素抵抗及其影响因素Wistar大鼠适应环境3天后根据体重随机分组：普通饲料组和高脂/高糖饲料组(HFS),HFS饲料依据猪油(F)、蔗糖(S)水平设计为10F10S(含10%猪油10%蔗糖,其余类推)、10F20S、20FOS、20F10S、20F20S,为比较果糖与蔗糖的差异另设10F20Fr组。每周监测体重,于第4、8周测定空腹和OGTT2h后血糖(FBG、PBG)；第8周时同时测定血脂水平。采用重复测量多元分析法探讨脂肪、糖对血糖、血脂的影响。3高血糖动物模型的建立及影响因素选择HFS饲料喂养大鼠55只,根据体重、血糖、血脂水平随机分为STZ0组(10只)、STZ20组(15只)、STZ25组(15只)和STZ30组(15只),分别注射0、20、25、30mg/kg,bw STZ,观察血糖与STZ用量的关系,确定合适用量。另选择不同配方饲料喂养大鼠(10F10S、10F20S、20F10S、10F20Fr)按上述确定剂量注射STZ造模,监测5周内的血糖变化,采用多变量方差分析探讨HFS饲料配方与STZ对造模的贡献,并根据大鼠的损伤强度、血糖水平和死亡率评估高血糖和糖尿病的判断标准。4高血糖动物模型的验证选择正常对照大鼠(Ctrl.).STZ对照大鼠(STZ-C)、HFS对照大鼠(HFS-C)、模型大鼠(Mod.),各组均随机分为2个亚组,1组每天接受15mg/kg/bw吡咯列酮治疗,另1组给与蒸馏水。14d后根据体重增长和血糖应答反应判断治疗疗效。经过洗脱期后处死大鼠,分析脏器、脂肪垫重量、胰岛素、C肽、糖原等指标。采用因子分析方法对指标进行归类,并评估不同饲料喂养下动物模型的优势。4动物模型复现性及应用性研究按照以上建立的造模程序,选择2队试验人员分别在2个动物房复制实验,统计3次重复测量的再现性限。另取100只大鼠分为3组：第一组进行抗性淀粉(RS)预防胰岛素抵抗实验,即在HFS饲料中加入20%RS,观察10周后血糖、胰岛素、血脂、糖原等指标与HFS对照组的差异；第二组在HFS诱导大鼠胰岛素抵抗成功后,采用20%、30%RS干预6周,观察血糖、胰岛素、血脂等指标的变化；第三组在HFS联合STZ诱导高血糖模型成功后,观察20%、30%RS对血糖、胰岛素、血脂等指标的影响。每组均设正常对照(Ctrl)和模型对照。研究结果1.正常大鼠血糖水平分布正常大鼠475只的FBG和238只的PBG分布范围95%上限分别为6.22mmol/L,10.3mmol/L;对血糖影响因素的分析显示：1)血糖仪法测定血糖的敏感性较低,和葡萄糖氧化酶法仅在血糖水平为7～10mmol/L时结果接近；2)不同来源的血样血糖存在一定差异,腹主动脉血比外周静脉血高1.4倍；3)采样前大鼠禁食时间对血糖的影响为禁食11h血糖低于禁食5h；4)取血后血样在60min内进行分离血糖衰减8%,如超过60min衰减达50%以上。根据以上因素重新整理数据,确定以葡萄糖氧化酶法测定的大鼠正常血糖上限为FBG6.2mmol/L, PBG8.0mmol/L;考虑到血源等不确定因素的影响,统计确定扩大系数1.3倍,由此外推扩大的血糖上限分别为FBG8.0mmol/L, PBG1lmmol/L2、高脂高糖饲料诱导胰岛素抵抗及其影响因素经HFS喂养大鼠体重增长明显高于普通饲料组,到4周时出现PBG升高,8周时FBG升高,且PBG超过普通饲料组2个标准差；同时TC、TC升高。当饲料猪油含量为20%时血糖水平最高,多变量分析显示猪油是影响血糖、血脂最大的因素,蔗糖可影响高血糖发生进程,果糖(20%)和蔗糖间没有显著差异。3高血糖动物模型的建立及影响因素在HFS饲养基础上,经小剂量STZ造模后HFS大鼠体重迅速下降,3周后血糖趋向稳定。根据血糖的高低、死亡率,确定20～25mg/kg.bwSTZ(?)注射剂量为宜；例料间血糖的差别为20F1OS>10F10S>10F20S=10F20Fr。对STZ与HFS交互作用分析显示HFS对STZ造模效果起到放大作用,其作用时间点仅在STZ注射前,猪油越高血糖越高,蔗糖反之。4高血糖动物模型的验证经过吡咯列酮治疗后,HFS大鼠体重回升且餐后血糖升高幅度下降,其中以小剂量STZ(20mg/kg.bw)制造的模型和以20F10S喂养的动物效果最为明显。对生化指标的分析显示模型大鼠出现典型肾肿大、肝糖原升高、胰岛素分泌以及HDL-C下降等生理生化变化。对影响因素的归因分析显示,STZ主要影响心、肾等脏器及糖原；HFS主页影响胰岛素分泌、糖原储存和血脂。5高血糖动物模型复现性和应用研究3次重复性检验显示,在规定的实验条件下均可诱导出符合要求的IR模型和T2DM模型,重复性检验相对偏差<20%。在RS预防和干预高血糖的应用研究中,HFS使大鼠PBG升高、空腹胰岛素下降、肝糖原升高、肌糖原下降(与Ctrl相比P<0.05)；给与20%RS的大鼠PBG和肝糖原明显低于HFS组(P<0.05),且空腹胰岛素未与对照组有明显统计学差异。对于餐后血糖和胰岛素升高、且胰岛素敏感指数下降的胰岛素抵抗模型大鼠,给以6周30%RS干预的大鼠虽未见血糖降低,但餐后胰岛素异常分泌下降,胰岛素敏感指数升高(和模型组相比P<0.05)。而对糖脂代谢紊乱的DM模型大鼠,30%RS可使大鼠LDL-C下降、FBG有下降趋势。结论1.综合考虑血糖分析方法、血样来源和处理方法、禁食时间等因素的影响,并使用高血糖模型大鼠进行相互验证的结果,确定以葡萄糖氧化酶法测定的大鼠正常血糖上限为FBG6.2mmol/L,PBG8.0mmol/L;扩大上限为FBG8.0mmol/L,PBG11mmol/L,可作为判断高血糖模型成功的依据。2脂肪、糖、STZ通过不同途径影响血糖,对造模贡献有所不同,其中脂肪是影响血糖、血脂、胰岛素分泌的最重要因素,小剂量STZ可在不影响胰岛素分泌的前提下使血糖迅速上升。3通过综合对血糖、胰岛素、敏感器官和血脂等相关指标的的归类分析,证实体重增长、脂肪堆积、肝糖原是伴随高血糖最突出的体征和生化改变,以体重和PBG作为分组的指标,以PBG作为高血糖模型判断标准可信度较高。IR模型的判断标准为PBG>8.0mmol/L且超过对照组2个标准差；T2DM的标准为PBG11～30mmol/L。4本研究证实了所建模型为具有胰岛素抵抗特征的高血糖动物模型,不同的饲料喂养可现示出不同的模型特点,高果糖摄入以增加TG和HDL-C为主,猪油主要影响脂肪堆积和胰岛素分泌；高蔗糖摄入可通过增加肌糖原储存而降低血糖。20mg/kg.bwSTZ因对机体损伤相对较轻、体征变化较轻,对胰岛素增敏剂的敏感性相对较强。5对模型稳定性和复制性的研究证实所建模型的复现性较强,由于不同阶段的模型具备不同的特点,所以在评价中可能需采用不同的评价指标。由于HFS诱导高血糖是一个缓慢的过程,因此本模型可用于长期的预防性或干预性研究和评价。本研究的创新之处：1.首次全面探讨了大鼠正常血糖分布范围和上限,为确定动物高血糖、糖尿病血糖判断标准提供了理论依据。2.首次探讨了脂肪、糖、STZ对高血糖动物模型的贡献和主要作用点,为解释模型和标化模型提供了依据。3.首次探讨了模型的稳定性、复现性,对关键技术条件进行了摸索,为修改保健食品辅助降血糖功能评价动物模型的建议提供了参考。